MRNA CRITICAL QUALITY ATTRIBUTE ANALYSIS USING A UPLC-TOF-MS SYSTEM AND CUSTOMIZED SOFTWARE

Význam tématu

RNA terapeutika, zejména mRNA vakcíny, se rychle prosazují ve farmacii a biotechnologiích. Kontrola kritických kvality atributů (CQA) jako 5´ capping, heterogenita poly A ocasu a sekvenční integrita je klíčová pro bezpečnost a účinnost produktu.

Cíle a přehled studie / článku

Prezentované studie demonstrovaly tři analytické workflow pro komplexní hodnocení mRNA CQA pomocí bench-top UPLC-TOF MS přístroje BioAccord a upraveného softwaru. Cílem bylo ověřit spolehlivost metody pro 5´ capping, profilování poly A ocasu a sekvenční mapování.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: syntetické sgRNA (100 mer), Firefly luciferase mRNA, Cypridina luciferase mRNA a oligonukleotid pro 5´ capping.
• Enzymatický štěpný protokol: RNase T1 digest pro fragmentaci RNA.
• Chromatografie: ion-pairing RPLC s mobilními fázemi A (8 mM DIPEA, 40 mM HFIP, pH 8.8) a B (4 mM DIPEA, 4 mM HFIP v 75 % ethanolu), lineární gradient 0–15 % B za 10 min, průtok 300 µl/min, kolona ACQUITY Premier OST 2.1 × 50 mm, 1.7 µm BEH C18.
• Detekce: UPLC-TOF MS BioAccord s vysokým rozlišením a rychlým sběrem dat.
• Software: INTACT Mass App pro vyhodnocení 5´ cappingu, heterogenity poly A ocasu a dekonvoluci MW, mRNA Cleaver App pro generování teoretických fragmentů, Sequence Viewer pro výpočet pokrytí a Confirm Sequence modul na platformě Waters Connect pro řešení nejednoznačných sekvencí.

Hlavní výsledky a diskuse

• 5´ capping: synteticky připravené Cap-1 bylo smícháno s prekurzorovými nečistotami v poměru 99 : 1 a vyhodnoceno s relací 97.3 % Cap-1 vůči 2.7 % vedlejších produktů, což dokládá vysokou citlivost a kvantitativní přesnost metody.
• Poly A heterogenita: po RNase T1 digestu bylo maximalizováno soustředění komponent do úzkého chromatografického pásma; dekonvoluce iontových řad odhalila průměrnou délku ocasu 126.5 nukleotidů.
• Sekvenční pokrytí: u ~100 mer sgRNA bylo dosaženo přibližně 75 % pokrytí na úrovni MS1. U luciferase mRNA (~4000 mer) byly díky zvýšené energii fragmentace a novým značkám sekvence vyhodnoceny nejednoznačné oblasti a doplněny do finální mapy.

Přínosy a praktické využití metody

Integrované workflow dovoluje rychlou a přesnou analýzu klíčových kvality atributů mRNA v jednom experimentu. Zvýšená citlivost, vysoké rozlišení a automatizovaný software snižují čas a manuální práci potřebnou pro interpretaci dat, což je přínosné pro vývoj, výrobu a kontrolu kvality RNA terapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj se zaměří na kombinaci dat MS1 a MS2 pro zvýšení sekvenčního pokrytí, plnou automatizaci analýzy s minimálním uživatelským zásahem a rozšíření metodiky na detekci modifikovaných nukleotidů a komplexních RNA struktur.

Závěr

Studie ukazuje robustní platformu pro komplexní hodnocení mRNA CQA pomocí BioAccord UPLC-TOF MS a pokročilého softwaru. Navržené workflow podporuje spolehlivou kontrolu kvality RNA terapeutik v rámci vývoje i rutinní QC laboratorních postupů.

Reference

• Waters Application Note 720008130 – RNA CQA Analysis using the BioAccord LC-MS System and INTACT Mass App
• Waters Application Note 720007329 – Rapid Analysis of Synthetic mRNA Cap Structure using Ion-Pairing RPLC with the BioAccord LC-MS System
• Waters Application Note 720007925 – Ion Pairing Reversed Phase LC-MS Analysis of Poly A Tail Heterogeneity using the BioAccord LC-MS System