mRNA Mapping with IP-RPLC-MS on a Low-Adsorption Flow Path

Význam tématu

Vakcinace a terapie založené na mRNA vyžadují důkladnou charakterizaci primární struktury, včetně sekvence, délky poly A ocasu a 5' cappingu, aby byla zajištěna účinnost, stabilita a bezpečnost bioterapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem je demonstrovat metodu mRNA mappingu pomocí iontově párové RPLC s hyphenací na MS (IP-RPLC-MS) na nízkoadsorpčním průtokovém traktu. Studie zkoumá:

• vliv pasivace a deaktivace nerezových povrchů na recoverii oligonukleotidů,
• analýzu poly A ocasu a 5' terminačního cappingu,
• sekvenční pokrytí pomocí enzymů RNase T1 a RNase 4 a jejich kombinace.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnuje digesci in vitro transkribované FLuc mRNA RNasami T1 a 4, následnou separaci IP-RPLC s využitím 15 mM TEA a 200 mM HFIP v mobilní fázi A a methanolu v B, gradientem 1–50 % B při průtoku 0,2–0,35 mL/min a detekcí UV 260 nm a negativní ESI-MS(/MS).

• Instrumentace: Agilent 1290 Infinity II Bio LC System s deaktivovanou C18 kolonkou 2,1×150 mm, 2,7 μm a Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF MS.
• Podmínky digesce: RNase T1 (37 °C, 30 min, Tris/EDTA), RNase 4 (denaturace v 1 M ureu, 37 °C, 1 h).
• Koncentrace digesátů do 3 µg/µL pomocí Centrivap koncentrátoru.

Hlavní výsledky a diskuse

• Porovnání SS vs deaktivované kolony: SS vykazuje postupnou pasivaci a ztrátu až 6,2 % oligonukleotidů, deaktivovaná kolona stabilní recoverii od první injekce (retence ~4,2 %), rozdíl 2 %.
• Distribuce subsekvencí: RNase T1 produkuje kratší oligonukleotidy (2–5 nt), RNase 4 delší (až 58 nt).
• Poly A ocas: symetrická distribuce délky 118–133 A, nejčastěji 124 (polydisperzita ~1,0007).
• 5' capping: identifikace cap-obsahujících oligo (trimer RNase T1, oktamer RNase 4), vypočtena cappingová účinnost 99,2 %.
• Sekvenční pokrytí ORF mRNA: RNase T1 pokryl 49,4 %, RNase 4 88,6 %, společně 94,7 % (96,9 % včetně opakujících se subsekvencí).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje komplexní charakterizaci mRNA pro QC a vývoj vakcín či terapeutik, zahrnuje simultánní analýzu sekvence, poly A ocasu a cappingu, s vysokou citlivostí a stabilitou díky nízkoadsorpčnímu traktu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozvoj HILIC-MS jako alternativy k IP-RPLC s nižšími nároky na organické iontové páry.
• Použití dalších RNas pro specifické mapování posttranskripčních modifikací.
• Automatizace workflow, integrace s bioinformatikou a LIMS.
• Analýza dalších mRNA platforem (self-amplifying RNA, LNP komplexy).

Závěr

Shrnutí prokazuje, že IP-RPLC-MS na nízkoadsorpčním průtoku poskytuje vysokou recoverii oligonukleotidů, detailní mapování primární struktury mRNA a analýzu poly A ocasu a cappingu, což přispívá k robustní QC bioterapeutik.

Reference

• Gau B. C. et al. Oligonucleotide Mapping Via Mass Spectrometry to Enable Comprehensive Primary Structure Characterization of an mRNA Vaccine Against SARS-CoV-2. Sci. Rep. 2023, 13, 9038.
• Wolf E. J. et al. Human RNase 4 Improves mRNA Sequence Characterization by LC–MS/MS. Nucleic Acids Res. 2022, 50, e106.
• Morreel K. et al. Diving into the Structural Details of In Vitro Transcribed mRNA Using Liquid Chromatography–Mass Spectrometry-Based Oligonucleotide Profiling. LCGC Europe 2022, 35, 220–236.
• Determining mRNA Capping with HILIC-MS on a Low-Adsorption Flow Path. Agilent Technologies application note, 5994-7118EN, 2024.
• Evaluation of Different Ion-Pairing Reagents for LC/UV and LC/MS Analysis of Oligonucleotides. Agilent Technologies application note, 5994-2957EN, 2021.