Quantitative analysis of 6 beta blockers on an LCMS-8045RX

Význam tématu

Beta-blokátory jsou široce používané léky v kardiologii a současně látky sledované v antidopingových programech. Kvantifikace těchto látek v biologických matricích i v čistých rozpouštědlech vyžaduje metody s vysokou citlivostí, selektivitou a robustností. Ultra-senzitivní LC-MS/MS metoda umožňuje detekci stopových koncentrací (sub-ng/mL), což je klíčové pro forenzní analýzy, kontrolu sportovců a farmakovigilanci.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit ultra-trace citlivou LC-MS/MS metodu pro současnou kvantifikaci šesti beta-blokátorů (atenolol, nadolol, acebutolol, metoprolol, propranolol, carvedilol) na přístroji Shimadzu LCMS-8045RX. Metoda měla dosáhnout nízkých mezí detekce (LOD) a kvantifikace (LOQ), dobrou linearitu v širokém rozsahu koncentrací a robustní výkon i v komplexních matricích (sigmatrix urine diluent).

Použitá metodika a instrumentace

Hlavní instrumentace a provozní parametry:

• LC systém: Nexera X3 (Shimadzu) spojený s triple-quadrupole hmotnostním spektrometrem LCMS-8045RX.
• Kolona: Shim-pack Velox Biphenyl, 2.7 µm, 2.1 × 100 mm.
• Mobilní fáze: A = 5 mM amonný formiát + 0.1 % kyseliny mravenčí ve vodě; B = 5 mM amonný formiát + 0.1 % kyseliny mravenčí v 1:1 methanol:acetonitril.
• Gradient: nízké % organiky na začátku, zvýšení do vysokého organického složení pro eluci a na konci vysoký organický flush pro ochranu kolony.
• Tok: 0.6 mL/min; objem injekce: 1 µL; teplota kolony: 40 °C.
• Ionizace: ESI v pozitivním módu; rozhraní CoreSpray/ESI; sušící a nebulizační plyny a teploty optimalizované pro maximální S/N (desolvation 650 °C, interface 400 °C, heat block 150 °C; suchý plyn 3 L/min; nebulizační plyn 7 L/min; ohřívací plyn 14 L/min).
• MRM: optimalizované přechody pro každý analyte (prekurzorové a dvě produktové ionty), řízené pomocí LabSolutions Connect MRM pro automatickou optimalizaci signálu.
• Příprava standardů: primární standardy 1 mg/mL v LCMS grade methanolu; kalibrační řady připravené v methanolu a v Sigmatrix urine diluent v rozsahu 0.010–100 ng/mL.

Hlavní výsledky a diskuse

Významné výsledky a jejich interpretace:

• Detekční limity: LOD 0.010 ng/mL pro všechny hodnocené analyty ve studii, identické pro methanol i Sigmatrix urine diluent. To ukazuje vynikající citlivost systému pro stopovou analýzu beta-blokátorů.
• Meze kvantifikace: LOQ se pohybovaly typicky v rozmezí 0.010–0.025 ng/mL v závislosti na analytech a matrici; některé analyty vykázaly LOQ 0.025 ng/mL v určité matrici.
• Linearita: kalibrační křivky pro rozsah 0.010–100 ng/mL vykázaly velmi dobrou linearitu s R2 > 0.995 pro všechny analyty, což potvrzuje spolehlivost kvantifikace přes čtyři řády koncentrací.
• Chromatografie a separace: všechny analyty byly dobře separovány na biphenylové kolóně s retenčními časy v rozmezí přibližně 1.04–3.05 min, což podporuje rychlý analytický běh a vysokou propustnost.
• Matricové efekty: LOD identické v obou testovaných matricích naznačují účinné potlačení nebo kompenzaci matricových vlivů při použití optimalizovaného MRM a vhodných provozních podmínek; u některých analyzů však LOQ mírně vzrostlo v Sigmatrix diluent, což je typické pro komplexnější prostředí.
• Provozní efektivita: použití automatizované optimalizace MRM a high-organic flush zvýšilo reprodukovatelnost signálu a udrželo integritu kolony při vyšším počtu injekcí.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy a oblasti aplikace:

• Antidopingová kontrola: metoda poskytuje dostatečnou citlivost pro detekci beta-blokátorů na úrovních relevantních pro WADA.
• Forenzní a toxikologické analýzy: nízké LOD/LOQ umožňují spolehlivé sledování expozice i při velmi nízkých koncentracích v močových matricích.
• Farmaceutická kontrola a výzkum: vhodné pro studie farmakokinetiky a monitoring stopových kontaminací v analytických procesech.
• Vyšší propustnost: krátké retenční časy a optimalizovaný flush zvyšují denní počet vzorků, což je výhodné pro rutinní laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

Směry dalšího rozvoje a implementace:

• Rozšíření panelu: integrace dalších kardiotropních a psychotropních látek do multianalyzních metod pro širší toxikologické profily.
• Standardy s izotopovými vnitřními standardy: použití stabilně izotopově značených IS pro korekci matricových efektů a zlepšení přesnosti.
• Automatizace a miniaturizace: zrychlení předúpravy vzorků (online SPE, mSPE) a snížení spotřeby rozpouštědel.
• Vyšší rozlišovací techniky: využití high-resolution MS pro potvrzující analýzu při komplexních matricích a neznámých metabolitech.
• Kvalitativní rozšíření: nasazení pro screening nových nebo modifikovaných beta-blokátorů, které se objevují v dopingových případech.

Závěr

Studie demonstruje robustní a vysoce citlivou LC-MS/MS metodu pro šest běžných beta-blokátorů s LOD 0.010 ng/mL a LOQ v rozmezí 0.010–0.025 ng/mL. Metoda kombinuje rychlou chromatografii na biphenylové kolóně, optimalizované MRM přechody a automatizovanou optimalizaci signálu, což vede k vynikající linearitě a vhodnosti pro aplikace v antidopingu, forenzní toxikologii a farmaceutickém výzkumu.

Reference

1. Pujos C. a kol., Comparison of the analysis of Beta-Blockers by different techniques, Journal of Chromatography B, 2009, 877(32), 4007–4014.
2. WORLD ANTI-DOPING CODE, International Standard - Prohibited List, 2021.