Practical LC–MS Workflows for siRNA and sgRNA Characterization Using a Single-Quadrupole Mass Spectrometer

Význam tématu

Analytika siRNA a sgRNA je klíčová pro kontrolu kvality a potvrzení syntézy oligonukleotidových terapeutik. Robustní a rutinně použitelná LC–MS metoda umožňuje potvrdit molekulovou hmotnost, profilovat nečistoty a sledovat integritu duplexních forem siRNA. Použití cenově dostupného single‑quadrupole zařízení s rozšířeným m/z rozsahem snižuje bariéru implementace v kontrolních laboratořích a vývojových týmech.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo demonstrovat praktické pracovní postupy LC–MS na single‑quad přístroji (Shimadzu LCMS‑2050, rozšířený rozsah do 3000 m/z) pro charakterizaci sgRNA a siRNA. Studie testovala různé ion‑pairing mobilní fáze, optimalizovala chromatografii a ionizační podmínky, porovnávala analýzu dissociovaných vláken versus nativního duplexu a ověřila použitelnost softwaru pro dekonvoluci a profilování nečistot.

Použitá metodika a instrumentace

V práci byly použity následující přístroje, kolonové systémy a softwarové nástroje:

• Nexera XSTM inert UHPLC spojené s LCMS‑2050 (single‑quadrupole) s rozšířeným rozsahem m/z až do 3000.
• Sloupec Shim-pack Scepter Claris C18‑300 (150 × 2.1 mm, 1.9 µm).
• Softwarové nástroje: LabSolutions MD (pro automatickou optimalizaci separace a návrh design space) a Insight Biologics ver. 2.2 (pro dekonvoluci a impurity profiling).
• Mobilní fáze (testované varianty): TEAA/TEA/HFIP, TBuAA (tributylammonium acetate) v různých organických složeníích, HAA (hexylammonium acetate), HFIP/TEA—konkrétní koncentrace a organické poměry byly optimalizovány pro každý analyt.
• MS podmínky (typické): ESI v negativním módu (DUIS), napětí rozhraní −2.0 kV, scan (profilový) 500–3000 m/z, nebulizační plyn 2.0 L/min, drying gas 5.0 L/min, heating gas 7.0 L/min, desolvation temp. 450 °C, DL temp. 200 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

Hlavní observační body a výsledky:

• sgRNA: molekulová hmotnost vypočtená Insight Biologics byla 32 275.06 Da (mass error ≈ −0.66 Da). Opakovaná měření vykazovala chybu typicky pod 1 Da u obou testovaných mobilních fází.
• Vliv ion‑pairingu: použití TBuAA vedlo k posunu k nižším nabitým stavům (tj. vyšší m/z), avšak velikost posunu byla mírná. HAA a TBuAA obecně snižovaly distribuované nabité stavy u siRNA.
• siRNA: při nízké teplotě chromatografické kolony (< 28 °C) zůstával duplex převládajícím chromatografickým píkem a díky rozšířenému m/z rozsahu LCMS‑2050 bylo možné pozorovat intactní duplex bez denaturace.
• Addukty: aduktace (např. HFIP nebo amoniakální/adukty z ion‑pair reagencií) byla pozorována. Optimalizací parametrů iontového zdroje bylo možné snížit tvorbu aduktů, což vedlo k vyšším celkovým iontovým signálům a přesnějším dekonvoluovaným hmotnostem.
• Impurity profiling: Insight Biologics automaticky dekonvoluovala spektra a identifikovala relativní podíly nečistot pro jednotlivé řetězce (příklad: u siRNA byly kvantifikovány jednotlivé N‑posunové produktové podpěry s podíly v procentech).
• Výkon single‑quad: přístroj s jednotkovým rozlišením a rozšířeným m/z byl schopen dodat dostačující přesnost hmotnosti pro potvrzení MW jak sgRNA, tak siRNA pro účely kontroly kvality.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy popsaného pracovního postupu:

• Nákladově efektivní řešení pro QC laboratoře: single‑quad s rozšířeným rozsahem poskytuje adekvátní data pro potvrzení syntézy a základní impurity profiling bez nutnosti vysokého rozlišení.
• Flexibilita analýzy: možnost volby mezi nativní (duplex intact) a denaturační analýzou pro rozlišení smyslu a antisensu vlákna.
• Rychlá optimalizace separace: použití LabSolutions MD umožnilo rychlé vybudování a hodnocení metod pro robustní separaci a výběr vhodných ion‑pairing podmínek.
• Zlepšení dat pomocí optimalizace zdroje: snížení aduktů přináší lepší dekonvoluci a spolehlivější kvantifikaci nečistot.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné směry dalšího rozvoje a aplikace:

• Rozšíření na větší a modifikované oligonukleotidy: adaptace mobilních fází a zdrojových parametrů pro ještě větší molekuly a netypické chemické modifikace.
• Integrace vyššího rozlišení: v případech, kde je nutná detailní identifikace isobarických nečistot, bude mít smysl kombinovat single‑quad workflow s high‑resolucí (TOF/Orbitrap) pro hloubkovou charakterizaci.
• Automatizace a škálovatelnost: další využití softwarů pro plnou automatizaci screeningových metod a reportingu v rámci rutinního QC.
• Optimalizace anti‑aduktových protokolů: vývoj mobilních fází a ionizačních postupů minimalizujících adukty a ion‑pair kontaminaci, zlepšení kvality dat.
• Native MS pro duplexní interakce: rozvoj metodiky pro zachycení komplexních interakcí a konformačních stavů duplexů v „native“ podmínkách.

Závěr

Studie prokázala, že single‑quadrupole LC–MS s rozšířeným m/z rozsahem je praktickým a spolehlivým nástrojem pro potvrzení molekulových hmotností sgRNA a siRNA a pro základní impurity profiling. Správná volba ion‑pairing činidel, nízká provozní teplota kolony pro zachování duplexu a optimalizace iontového zdroje jsou klíčové pro získání kvalitních dat. Kombinace LabSolutions MD a Insight Biologics poskytuje uživatelsky přívětivý workflow vhodný pro rutinní laboratorní provoz.

Reference

1. V. Johnson, K. Luo, R. Suzuki, A. Toyama, J. Dahl, K. Uchiyama, T. Matsubara. Practical LC–MS Workflows for siRNA and sgRNA Characterization Using a Single‑Quadrupole Mass Spectrometer. MP 534. Shimadzu Scientific Instruments / Shimadzu Corporation.