Reversed-Phase Ion-Pair LC/MS Analysis of siRNA under Denaturing and Non-Denaturing Conditions

Význam tématu

Oligonukleotidové terapie, mezi které patří antisense a siRNA, představují moderní přístup k léčbě genetických a dosud nevyléčitelných onemocnění. Kvalitativní i kvantitativní charakterizace siRNA je zásadní pro kontrolu kvality a bezpečnost finálního léčiva. Reversed-phase ion-pair LC/MS umožňuje spolehlivě rozlišit a analyzovat oba konformační stavy siRNA – jednoreťazcový (denaturovaný) a dvouřetězcový (nativní) – pouhou změnou teploty kolony, což usnadňuje validaci výrobního procesu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat schopnost přístroje LCMS-9050 ve spojení s UHPLC Nexera XS inert provést analýzu siRNA v denaturujících i nondenaturujících podmínkách. S využitím softwaru LabSolutions Insight Biologics byla navíc zkoumána možnost paralelní analýzy více sekvencí oligonukleotidů.

Použitá instrumentace

• UHPLC systém Nexera XS inert
• Kolona Shim-pack Scepter Claris C18-300 (100 mm × 2,1 mm, 1,9 µm)
• Hmotnostní spektrometr LCMS-9050 (Q-TOF)
• Software LabSolutions Insight Biologics

Použitá metodika

Pro separaci byla zvolena reverzní fáze s ion-pair činidly (100 mM HFIP, 10 mM TEA) na vodní/methanolové eluci s gradientem 5 – 50 – 90 – 5 % B během 25 min. Průtok činil 0,3 mL/min, objem injekce byl 1 µL. Teplota kolony se střídala mezi 25 °C (nondenaturující podmínky) a 60 °C (denaturující podmínky). MS nastavení: ESI negativní režim, m/z 550 – 2500, průtok nebulizačního plynu 2 L/min, sušící plyn 10 L/min, interface 350 °C, DL 250 °C, block heater 400 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

Při 60 °C se duplexní siRNA dissociovala na samostatné sense a antisense řetězce, které byly detekovány na odlišných retenčních časech. Při 25 °C byl však zachován dvouřetězcový komplex s vyšším retenčním časem (~7,5 min). Software Insight Biologics automaticky identifikoval a dekonvoluoval MS1 spektra obou řetězců za obou teplotních režimů a poskytl komponentní chromatogramy pro každou sekvenci.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a spolehlivá detekce konformačních stavů siRNA jediným analytickým během
• Možnost simultánní analýzy více oligonukleotidových sekvencí
• Automatizovaná identifikace a kvantifikace pomocí dedikovaného softwaru
• Uplatnění v R&D, kvalitativní a kvantitativní kontrole výroby terapeutií

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření použití LC/MS analytických protokolů pro nové modifikované oligonukleotidy a Messenger RNA (mRNA). Integrace umělé inteligence do softwaru pro ještě rychlejší vyhodnocení vzorků a prediktivní modelování separace přinese další zvýšení efektivity vývoje a kontroly kvality bioterapeutik.

Závěr

Studie prokázala, že kombinace UHPLC Nexera XS inert a hmotnostního spektrometru LCMS-9050 se softwarovým balíčkem LabSolutions Insight Biologics představuje robustní řešení pro komplexní analýzu siRNA. Nastavení teploty kolony umožňuje volit mezi denaturujícími a nondenaturujícími podmínkami, což usnadňuje detailní charakterizaci léčivých oligonukleotidů.

Reference

1. Nakazono J. Reversed-Phase Ion-Pair LC/MS Analysis of siRNA under Denaturing and Non-Denaturing Conditions. Shimadzu Application News No. 01-00915-EN, Jul. 2025.
2. Application News No. 01-00595A-EN. An Oligonucleotide Impurity Analysis Workflow Using LabSolutions Insight Biologics Software.
3. Application News No. 01-00656A-EN. Simple Analysis of Impurities in Oligonucleotide Therapeutics Using a Single Quadrupole Mass Spectrometer.
4. Application News No. 01-00898-EN. Efficient Method Development for Separation of Capped mRNA Fragments.