APPLICATION SOLUTIONS FOR OLIGONUCLEOTIDES - APPLICATION NOTEBOOK

Význam tématu

– RNAi, antisense (ASO), siRNA a další oligonukleotidy představují revoluční třídu terapeutik, zvyšujících specifitu a účinnost léčby.
– Pro vývoj a schválení oligonukleotidových léčiv je nezbytná spolehlivá separace, purifikace a podrobná analýza nečistot.
– Metody s vysokým chromatografickým rozlišením a hmotnostní detekcí (LC-MS) jsou klíčové pro kontrolu kvality a zrychlení vývoje.

Cíle a přehled studie

– Představit komplexní portfolio metod UPLC a UPLC-MS pro analýzu syntetických oligonukleotidů.
– Optimalizovat chromatografické podmínky (modifikace gradientů, ion-pair činidla, teplota) pro různé třídy oligonukleotidů (DNA, RNA, modifikované, duplexy, fosforotioáty, PEG).
– Ilustrovat výhody nových ion-pair systémů (HAA) pro snížení nákladů a aduktů.
– Ukázat využití různých detekčních technik: UV, QDa®, QTof a HDMS® pro rutinní i pokročilé aplikace.
– Integrovat automatizované zpracování dat s ProMass HR pro vysokou propustnost.

Použitá metodika a instrumentace

• ACQUITY UPLC H-Class a XBridge Alliance HPLC systémy
• OST C18 a BEH C18 kolony, 1.7–2.5 μm, 2.1–4.6 mm I.D.
• Ion-pair RP-LC eluenty: TEAA, TEA-HFIP, HAA, MeCN/MeOH
• Detekce: UV (TUV/PDA), QDa Single Quadrupole MS, Xevo™ G2-XS QTof, SYNAPT® HDMS
• Softwarové nástroje: MassLynx®, MaxEnt, MaxEnt3, ProMass HR, DriftScope

Hlavní výsledky a diskuse

• UPLC oproti HPLC zkrátilo dobu analýzy na 2–10 min a zlepšilo separaci krátkých/
  dlouhých oligonukleotidů, duplexů i modifikovaných forem
• Metodika kontinuálního gradientu a regulace průtoku umožnila udržet konstatní chromatografické objemy při zkrácení mezery
• HAA jako levné IP činidlo dosahuje rozlišení srovnatelné či lepší než TEA-HFIP a je kompatibilní s duplexy
• QDa/MS detekce potvrdila hmotnost cílových sekvencí i nečistot, dekonvoluce MaxEnt/MaxEnt3
• ProMass HR zjednodušuje a zrychluje analýzu LC-MS dat v režimu batch s barevným webovým rozhraním
• HDMS přidává ion mobility separaci pro identifikaci drobných kontaminantů a izomerů
• MS/MS na SYNAPT umožňuje full ladder sekvenování siRNA s charakteristickými c-, y-ionty

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlejší vývoj analýz a vyšší propustnost laboratoře s 4×–5× zkrácením času analýzy
• Nižší náklady díky nižšímu objemu IP činidel a vyšší automatizaci zpracování dat
• Komplexní charakterizace oligonukleotidů i PEG materiálů pro PEGylaci biologik
• Zlepšení kontroly kvality a dokumentace pro regulatorní agentury

Budoucí trendy a možnosti využití

– Rozvoj UHPLC-MS metod s vyššími tlaky a sub-1 μm částicemi pro další zvýšení rozlišení
– Širší nasazení ion mobility-MS (PASEF, TIMS-TOF) pro komplexní polymery a biologiky
– Integrace AI a strojového učení pro prediktivní vývoj metod a interpretaci dat
– Adaptace metod pro nové modifikované a konjugované oligonukleotidy, mRNA a CRISPR
– PostUPLC IM-MS pro detailní mapping kontaminantů a degradace

Závěr

Díky spojení ACQUITY UPLC OST Column technologie a škály MS detektorů (QDa, QTof, HDMS) lze generovat rychlé, citlivé a spolehlivé metody pro
separaci, purifikaci a charakterizaci oligonukleotidů. Automatizace s ProMass HR zkracuje čas interpretace LC-MS dat a podporuje vysokou propustnost.
Metody pokrývají široké spektrum aplikací od čistění duplexů až po detailní MS/MS sekvenování siRNA a monitoring PS i PEG produktů.

Reference

1. Gilar M. et al. Ion-Pair Reversed-Phase HPLC Analysis of Oligonucleotides. J. Chromatogr. A 2002;958:167–182.
2. Fountain K.J. et al. LC-ESI-MS Analysis of Native and Chemically Modified Oligonucleotides. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003;17(7):646–653.
3. Apffel A. et al. HPLC-ESI-MS of Nucleotides and Oligonucleotides. J. Chromatogr. A 1997;777:3–21.
4. McGinnis A.C. et al. Chromatographic Methods for Therapeutic Oligonucleotides. J. Chromatogr. B 2012;883–884:76–94.
5. Birdsall R. et al. QDa Detection in Oligonucleotide Analysis. Waters App. Note 2016;720005632EN.
6. Ivleva V. et al. ProMass for MassLynx in Oligonucleotide Analysis. Waters App. Note 2010;720003577EN.
7. Shion H. et al. Integrated LC-MS Workflow for Oligonucleotides. Waters App. Note 2017;720002873EN.
8. McLuckey S.A. et al. RNA Oligonucleotide Fragmentation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1992;3(1):60–70.
9. Nilsson M. et al. IMS-MS in RNA Structural Analysis. Anal. Chem. 2005;77(16):5110–5115.
10. Mack D. et al. PEG Characterization by HDMS. Waters App. Note 2007;720002384EN.