Altura Size Exclusion 300 Å Allows Significant Gains in Performance at Low Salt Concentrations

Význam tématu

Size exclusion chromatography (SEC) je klíčová technika pro hodnocení velikostních atributů bioterapeutik (agregace, konformační změny, polymerizace). Nonspecifická adsorpce na kovové a jinak nabité povrchy_COLUMN vede k roztažení píků, ztrátě citlivosti a sníženému rozlišení, což nutí laboratoře používat vysoké koncentrace iontů v mobile fázi. Snížení takových interakcí umožňuje analyzovat citlivé proteiny při nižších koncentračních podmínkách, zlepšuje kompatibilitu se sestupnými workflow (např. MS) a omezuje opotřebení LC přístrojů.

Cíle a přehled studie / článku

Studie porovnává výkon standardního nerezového SEC hardware se sloupci Agilent Altura SEC 300 Å upravenými technologií Ultra Inert, která eliminuje kovové vazby. Hlavním cílem bylo kvantifikovat vliv Ultra Inert povrchu na nespecifickou adsorpci, tvar píků a citlivost při různých koncentracích NaCl (25–500 mM) pro směs malých proteinů, monoklonálních protilátek (mAb) a antibody–drug conjuga­tů (ADC).

Použitá instrumentace

• Agilent Infinity III 1260 Multiple wavelength detector (p/n G7165A)
• Agilent Infinity III 1260 Multicolumn thermostat (p/n G7116A)
• Agilent Infinity III 1260 Bio multisampler (p/n G5668A)
• Agilent Infinity III 1260 Bio-inert pump (p/n G5654A)
• Kolony: Agilent AdvanceBio SEC 300Å, 4.6 × 300 mm, 2.7 μm a Agilent Altura SEC 300Å, 4.6 × 300 mm, 2.7 μm (s Ultra Inert povrchem)
• Softwarové nástroje: Agilent OpenLab CDS Acquisition a Analysis verze 2.8

Použitá metodika

Vzorky: proteiny a bioterapeutika 1 mg/mL ve 50 mM fosfátovém pufru pH 7.0. Mobilní fáze: eluent A = 50 mM fosfát pH 7.0; eluent B = 50 mM fosfát pH 7.0 + 500 mM NaCl; požadované hodnoty NaCl (25, 50, 100, 250, 400, 500 mM) byly dosaženy mísením A a B. Podmínky: průtok 0.35 mL/min, teplota 25 °C, injekční objem 1 µL, detekce UV při 220 nm. Měřené parametry zahrnovaly faktor tailingu (peak tailing), eluční časy a procento agregátů (HMW).

Hlavní výsledky a diskuse

• Ultra Inert povrch výrazně snížil nespecifické kovové vazby a tím i tailing u proteinů s kladným povrchovým nábojem (vysoké pI). U lysozymu (pI 11.4) byl tailing při nízkém solném obsahu (25 mM NaCl) snížen více než 2× (přibližně z TF 9.25 na 4.46), u α‑chymotrypsinogenu podobně výrazná redukce.
• U mAb a ADC citlivých na kovové vazby (např. rituximab pI 9.4, sacituzumab govitecan pI 8.5) se na nerezovém hardware při 25 mM NaCl objevily extrémně nízké nebo chybějící signály, zatímco Altura umožnila detekci a tvarování píků.
• Při vysokých koncentracích soli (≈500 mM NaCl) se rozdíly mezi nerezem a Ultra Inert snižují, protože iontické síly překrývají kovové vazby. Nicméně vyšší sůl zároveň posunuje eluce směrem k delším časům, což indikuje vznik hydrofobních interakcí a může zhoršit výkon a opotřebení LC systému.
• Detekce a kvantifikace agregátů (HMW) byla s Altura sloupci citlivější — u ADC byla zjištěna vyšší naměřená procentuální agregace (např. +≈1 %) a lepší rozlišení mezi hlavním a agregátními píkami (např. Rs Altura 1.41 vs SS 1.33 u konkrétního příkladu).
• Proteiny s kyselým povrchem (nízké pI, např. eculizumab pI 6.1, ovalbumin pI 5.1) nebyly významně ovlivněny ani změnou hardware, ani solí; u těchto vzorků byl rozdíl minimální.
• Studie také upozorňuje na potřebu optimalizace soli pro každý protein: příliš nízká sůl vede k adsorpci na kov, příliš vysoká k hydrofobním efektům a možnému zvýšení agregace.

Přínosy a praktické využití metody

• Altura Ultra Inert hardware umožňuje provoz SEC při výrazně nižších koncentracích soli, čímž se zachovává nebo zvyšuje citlivost a symetrie píků pro kovově‑senzitivní biopolymerní analyty.
• Snížení potřeby vysokých solí zlepšuje kompatibilitu s následnými analytickými metodami (např. hmotnostní spektrometrie) a snižuje riziko koroze a usazování v LC soustavách.
• V praxi to znamená lepší kvantifikaci agregátů jako klíčového kritického atributu (CQA) v kontrolách kvality bioterapeutik a větší flexibilitu při vývoji platformních SEC metod.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rostoucí adopce inertních povrchů v kolónách a celých bio‑LC systémech pro zvýšení přesnosti QC metod v biotechnologii a farmaceutickém vývoji.
• Integrace Ultra Inert sloupků s metodami senzitivními na sůl (např. nativní MS) umožní přímější přechod mezi separací a identifikací bez nutnosti rozsáhlé úpravy vzorku.
• Další optimalizace mobilních fází zaměřená na minimalizaci hydrofobních interakcí při středních solných koncentracích, včetně použití pufrů s upraveným pH nebo aditiv, které nenarušují biologickou strukturu.
• Možnost použití Ultra Inert technologie ve vývoji platformních metod SEC pro regulované prostředí, s potenciálem snížit opakované přerábění vzorků a zkrátit validační cykly.

Závěr

Agilent Altura SEC 300 Å s Ultra Inert povrchem významně redukuje kovově indukované nespecifické adsorpce a zlepšuje tvar píků, citlivost a schopnost kvantifikovat agregáty při nižších koncentracích NaCl. To umožňuje širší rozmezí použitelných mobilních fází, lepší rozlišení HMW komponent a vyšší robustnost SEC metod zejména pro proteiny a konjugáty s vysokým povrchovým nábojem. Uživatelé by měli optimalizovat koncentraci soli pro každý analyzovaný protein, přičemž Ultra Inert hardware snižuje nutnost spoléhání se na vysoké iontické síly.

Reference

1. Kříž, Z.; et al. How Ionic Strength Affects the Conformational Behavior of Human and Rat Beta Amyloids – A Computational Study. PLoS ONE 2013, 8(5). doi:10.1371/journal.pone.0062914.
2. Rabe, M.; Verdes, D.; Seeger, S. Understanding Protein Adsorption Phenomena at Solid Surfaces. Advances in Colloid and Interface Science 2011, 162(1–2), 87–106. DOI: 10.1016/j.cis.2010.12.007.
3. ICH Q6B. Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products. 1999. (Směrnice ICH Q6B pro hodnocení HMW/LMW, dostupné v databázi ICH.)