Altura Size Exclusion 130 Å Allows Comprehensive Analysis of GLP-1 Analogues Over a Broad pH Range

Význam tématu

Glukagon‑like peptid‑1 (GLP‑1) analogy jsou rychle rostoucí třídou terapeutických peptidů používaných v léčbě metabolických onemocnění. Vzhledem k rozsáhlým chemickým modifikacím vedoucím k četným příbuzným nečistotám a k tendenci k agregaci představují tyto látky významnou analytickou výzvu pro QC a vývoj biosimilarů. Robustní, reprodukovatelná a inertní size exclusion chromatografie (SEC) je klíčová pro detekci agregátů, kontrolu kvality a podporu vývoje metod.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo systematicky vyhodnotit vliv pH a podílu organického rozpouštědla (acetonitril) na chromatografický průběh GLP‑1 analogů (liraglutid, semaglutid, exenatide) a posoudit přínos nového Agilent Altura SEC 130 Å sloupce s Ultra Inert hardwarem ve srovnání se stejným sorbentem v nerezovém pouzdru a s inertním konkurenčním sloupcem. Studie se zaměřila na zlepšení tvaru píku, snížení netypických interakcí (metal binding, silanoly) a na optimalizaci prostoru metodického návrhu pro analytickou i výrobní podporu.

Použitá metodika

Krátký přehled experimentálního přístupu:

• Analyty: liraglutid, semaglutid, exenatide; vzorky 1 mg/mL v 1× PBS pH 7.4.
• Sloupce: Agilent AdvanceBio SEC 130 Å (4.6 × 300 mm, 2.7 μm), Agilent Altura SEC 130 Å Ultra Inert (stejné rozměry), Agilent Altura SEC 300 Å Ultra Inert, konkurenční inertní SEC (přibližně 125 Å, 4.6 × 300 mm, 2.5 μm).
• Mobilní fáze: čtyři komponenty – A: 1× PBS pH 7.4; B: směs kyseliny octové a argininu (pH ~2); C: 0.1 % ammonium trifluoroacetátu (pH 8.5); D: acetonitril. Byly testovány kombinace s ACN v rozmezí ~10–50 % a pH hodnoty reprezentované eluenty A, B a C.
• Podmínky: průtok 0,35 mL/min, teplota kolony 25 °C, injekční objem 1 μL, detekce UV při 220 nm, doba běhu 20 min.
• Screening: multiparametrické matice pH vs. %ACN vs. pórovitost (130 vs. 300 Å) pro vyhodnocení eluce, šířky a tailingu.

Použitá instrumentace

• Agilent Infinity III 1260 Multiple wavelength detector (G7165A)
• Agilent Infinity III 1260 Multicolumn thermostat (G7116A)
• Agilent Infinity III 1260 Bio multisampler (G5668A)
• Agilent Infinity III 1260 Bio‑Inert Pump (G5654A)
• Software: Agilent OpenLab CDS Acquisition a Analysis verze 2.8

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčová pozorování:

• Vliv pH: Zvýšení pH od 2 do 8.5 obecně vedlo ke snížení retence (posun eluce) u všech testovaných GLP‑1; to odpovídá tendenci tvořit vyšší oligomery v oblasti pH ~6–9, což ovlivňuje hydrodynamický objem a chování při SEC.
• Specifická citlivost na modifici K26: Liraglutid (palmitát) a semaglutid (stearová di‑kyselina) vykazovaly silnou závislost tvaru píku na %ACN a pH, zatímco exenatide (bez mastné kyseliny) byl méně ovlivněn. Nízké %ACN (10 %) vedly k rozšířeným, neostře definovaným tvarům u liraglutidu a semaglutidu napříč pH.
• Vliv pórovitosti: Použití širších pórů (Altura SEC 300 Å) pomohlo identifikovat a oddělit agregáty (vyhnutí se úplnému vyloučení vyšších agregátů), zatímco 130 Å sloupce poskytly lepší symetrii a rozlišení fragmnetů po optimalizaci podmínek.
• Výhody Ultra Inert hardware: Přesné zabalení stejného sorbentu do Altura Ultra Inert pouzdra výrazně snížilo netypické adsorpce na kovové povrchy. V porovnání s nerezovým provedením došlo ke snížení tailingu přibližně o více než 60 % pro liraglutid, ~60 % pro exenatide a ~30 % pro semaglutid v mnoha testovaných podmínkách; ve srovnání s konkurenčním inertním sloupcem byly v některých případech zlepšení až do ~75 %.
• Důsledky pro účinnost: U semaglutidu vedlo snížení tailingu u Altura k lepší detekci a rozlišení fragmentů a agregátů bez významného zhoršení účinnosti (FWHM často zachováno nebo zlepšeno), zatímco u nerezových sloupců tailing vedl ke ztrátě signálu a snížené viditelnosti souvztažných komponent.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické implikace zjištění:

• Nasazení Altura Ultra Inert sloupců rozšiřuje metrologický prostor — umožňuje použití širšího rozsahu pH a %ACN bez výrazného rizika metal bindingu, což zjednodušuje screening metod pro nově modifikované GLP‑1 analogy.
• Pro QC a vývoj biosimilarů poskytuje kombinace vhodného pórového rozměru (130 vs. 300 Å), optimalizovaného pH a organické fáze spolehlivou cestu k rozlišení monomerů, fragmentů a agregátů.
• Nižší tailing zlepšuje kvantifikaci stopových fragmentů a agregátů, zvyšuje reproducibilitu a usnadňuje přenos metody mezi laboratořemi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry a doporučení:

• Rozvoj GLP‑1 terapeutik s rozmanitými modifikacemi (zejména v pozici K26) bude vyžadovat pravidelné screenování kombinací pH, %ACN a pórovitosti sloupce při vývoji metod SEC.
• Další vylepšení sloupcové hardware (další zlepšení inertnosti, minimalizace povrchově‑aktivních míst) posunou možnosti SEC blíže k bezinterakční separaci peptidů a lipopeptidů.
• Integrované workflow kombinující SEC s orthogonálními technikami (MALS, MS, hyphenované techniky) poskytnou komplexní charakterizaci agregátů, aduktů a modifikací.
• Automatizace screeningu podmínek a využití menších objemů/injekcí pro vysokopropustné hodnocení více variant GLP‑1 budou zvyšovat efektivitu vývojových studií.

Závěr

Studie demonstrovala, že kombinace vhodného pH, organické složky a volby pórovitosti sloupce je nezbytná pro spolehlivou SEC analýzu GLP‑1 analogů. Nasazení Agilent Altura Ultra Inert 130 Å/300 Å sloupců významně redukuje netypické interakce, zlepšuje symetrii píků a obnovuje schopnost detekce agregátů a fragmentů v širokém spektru podmínek. To je zvláště důležité pro analytickou podporu vývoje biosimilarů a QC, kde pevná metodika pro sledování velikostních heterogenit má přímý dopad na bezpečnost a kvalitu léčiv.

Reference

1. Giannetti M.; et al. A Spectroscopic and Molecular Dynamics Study on the Aggregation Properties of a Lipopeptide Analogue of Liraglutide, a Therapeutic Peptide Against Diabetes Type 2. Molecules 2023, 28(22), 7536. doi:10.3390/molecules28227536.
2. Castelletto V.; et al. Fibrillar and Micellar Aggregation of Semaglutide and Formation of a Chiral‑Imprinted Glass. Biomacromolecules 2026, 27(4), 2818–2827. doi:10.1021/acs.biomac.5c02669.
3. Benet A.; et al. The Effects of pH and Excipients on Exenatide Stability in Solution. Pharmaceutics 2021, 13(8), 1263. doi:10.3390/pharmaceutics13081263.