Improved Analysis of Intact Proteins and Peptides by Reversed Phase HPLC Using the Altura Ultra Inert PLRP-S 1000 Å Column

Význam tématu

Analýza intaktních proteinů a peptidů reverzní fázovou HPLC s MS detekcí je zásadní v kontrole kvality biologických léčiv. Umožňuje přesné stanovení molekulové hmotnosti, identifikaci proteoform a post‑translačních modifikací (PTM) a kvantifikaci parametrů kritických pro účinnost léčiv, například poměru náboje lék‑protilátka u ADC (DAR). Minimalizace nespecifických interakcí s chromatografickým systémem významně zvyšuje citlivost a spolehlivost těchto analýz.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo porovnat výkonnost klasické PLRP‑S 1000 Å kolony v nerezovém provedení se slovně upravenou Altura Ultra Inert PLRP‑S 1000 Å kolonkou u analýzy intaktních mAb, ADC, malých peptidů a globulárních proteinů. Studie sledovala zejména dobu pasivace (nutnost opakovaných injekcí), návratnost signálu, kvalitu dekonvoluovaných MS spekter a schopnost detekce PTM včetně kvantifikace DAR u ADC.

Použitá metodika

Analytické podmínky byly navrženy pro RP‑LC/MS intaktních biomolekul za použití MS‑kompatibilních elučních podmínek (0,1 % kyseliny mravenčí) a širokopórového (1000 Å) PS/DVB stacionárního fáze PLRP‑S. Klíčové body metodiky:

• Kolony: PLRP‑S 1000 Å, 2.1 × 50 mm, 5 µm; standardní a Altura Ultra Inert (stejná plochá fáze, rozdíl v inertním kovovém pouzdře).
• Mobilní fáze: A = 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě; B = acetonitril + 0,1 % kyselina mravenčí.
• Tok: 0,21 mL/min; teplota kolony 65 °C; injekční objem 1 µL; běh ~10 min s postupným zvýšením %B dle gradientu (počátečně 25 % B, zvýšení na 50 % při 5–10 min, krátký flush na 99 % B, návrat do výchozích podmínek).
• Příprava vzorků: 1 mg/mL v 0,1 % kyselině mravenčí.

Použitá instrumentace

Hodnotící aparatura a softwarové nástroje:

• HPLC: Agilent 1290 Bio (multicolumn thermostat G7116B, multisampler G7137A, high‑speed pump G7132A).
• MS: Agilent 6530 Q‑TOF.
• Softwarové nástroje: Agilent MassHunter Workstation v10.1, Qualitative Analysis B.07, Agilent DAR calculator B01.01.
• Laboratorní chemikálie: LC/MS acetonitril, LC/MS kyselina mravenčí, ultrapure voda (Milli‑Q).

Hlavní výsledky a diskuse

Studie prokázala konzistentní zlepšení výkonu při použití Altura Ultra Inert kolony oproti běžnému nerezovému pouzdru:

• Pasivace a reprodukovatelnost: Altura dosahovala stabilního signálu již od 3. injekce, zatímco nerezová kolona vyžadovala až ~20 injekcí k dosažení srovnatelné intenzity.
• Návratnost (recovery): u mAb a ADC přibližně ~10 % vyšší signál (u konkrétních vzorků: sacituzumab govitecan ~8 % vyšší při větším naložení; atezolizumab ≈5 % vyšší), u malých peptidů a drobných globulárních proteinů výrazné zlepšení (exenatide téměř dvojnásobná návratnost; lysozym ≈15 % lepší oproti nerezovému provedení).
• Kvalita MS spekter: zvýšená intenzita vedla k čistším dekonvoluovaným spektrům, lepšímu rozlišení proteoform a detekci drobných PTM (např. ztráty lysinů −128/−256 Da u mAb).
• Analýza ADC: Altura poskytla dostatečnou separaci a intenzitu pro spolehlivou kvantifikaci DAR u sacituzumab govitecan (validated DAR 7.6) a umožnila detekci ztráty SN‑38 (-418 Da) na těžkých i lehkých řetězcích.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické výhody implementace Altura Ultra Inert PLRP‑S 1000 Å v prostředí QC a výzkumu zahrnují:

• Rychlejší uvedení kolony do provozu díky dramaticky snížené době pasivace, což šetří čas a materiál (méně opakovaných injekcí).
• Vyšší citlivost a lepší reproducibilita pro široké spektrum bioterapeutik (mAb, ADC, peptidy, malé proteiny).
• Zlepšená kvalita dat pro identifikaci PTM a přesné stanovení DAR, což je klíčové pro bezpečnost a účinnost ADC.
• Vhodné řešení tam, kde jsou kritické nízké koncentrace analyzovaných forem nebo tam, kde interakce s kovovým povrchem vede k chybějícím nebo zatajeným signálům.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry a aplikace této technologie:

• Rozšíření užití inertních kovových pouzder a speciálních stacionárních fází (PS/DVB) pro široké spektrum bioanalytických metod, včetně top‑down a intact mass aplikací.
• Optimalizace workflow pro vysokopropustné (high‑throughput) QC laboratoře, kde čas pasivace a stabilita signálu výrazně ovlivňují produktivitu.
• Kombinace s pokročilými softwarovými nástroji pro automatizované určení DAR a vyhodnocení proteoform napomůže standardizaci dat mezi laboratořemi a projekty.
• Další vývoj materiálů kolony a povrchových úprav cílených na redukci specifických adsorpčních dějů (fosforylované formy, oligonukleotidy apod.).

Závěr

Altura Ultra Inert PLRP‑S 1000 Å nabízí prakticky významné zlepšení pro RP‑LC/MS intaktních biopolymerů díky kombinaci širokopórové PS/DVB stacionární fáze a inertního kovového pouzdra. Výsledkem je nižší potřeba pasivace, vyšší návratnost signálu, lepší kvalita MS dat a spolehlivá identifikace PTM a kvantifikace DAR u ADC. To z ní činí vhodný nástroj pro QC i výzkum v oblasti biotherapeutik.

Reference

1. Donnelly, D. P.; et al. Best Practices and Benchmarks for Intact Protein Analysis for Top‑Down Mass Spectrometry. Nature Methods 2019, 16(7), 587–594. doi:10.1038/s41592-019-0457-0.
2. McCalley, D. V.; Guillarme, D. Evaluation of Additives on Reversed‑Phase Chromatography of Monoclonal Antibodies Using a 1000 Å Stationary Phase. J. Chromatogr. A 2020, 1610, 460562. doi:10.1016/j.chroma.2019.460562.
3. Kopp, A.; et al. Antibody–Drug Conjugate Sacituzumab Govitecan Drives Efficient Tissue Penetration and Rapid Intracellular Drug Release. Molecular Cancer Therapeutics 2022, 22(1), 102–111. doi:10.1158/1535-7163.mct-22-0375.