High-throughput, multiplexed phosphoproteomics with Fe-NTA magnetic beads enrichment and TMTpro 32plex quantification on Orbitrap Tribrid MS

Význam tématu

Phosphoproteomika mapuje fosforylační události, které regulují buněčné signální sítě a jsou klíčové pro pochopení onkologie, odpovědi na léčbu a dynamiky signálních drah. Kvantitativní, multiplexní přístup umožňuje paralelní srovnání velkého počtu podmínek nebo buněčných linií, čímž se výrazně zvyšuje biologická vypovídací schopnost experimentů a efektivita využití instrumentálního času.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované studie bylo ukázat vysokoprůtokový workflow pro kvantitativní phosphoproteomiku kombinující TMTpro 32plex štítkování, magnetické Fe-NTA obohacení fosfopeptidů a offline vysoké-pH reverzní fáze frakcionaci, s analýzou na Orbitrap Tribrid hmotnostním spektrometru. Studie demonstrovala citlivé zjišťování a relativní kvantifikaci fosfoproteomů napříč šesti nádorovými buněčnými liniemi a různými stimulacemi.

Použitá metodika a instrumentace

Postup zahrnoval kultivaci 6 buněčných linií (A549, MCF7, Hs578T, LNCaP, HCT116, HepG2), lyzi v přítomnosti inhibitorů fosfatáz, acetonuem precipitaci a tryptickým štěpením (EasyPep). 1 mg každého lyzátu byl rozdělen a označen TMTpro 32plex reagensy; zkumavky se spojily do multiplexovaného poolu s dvěma kontrolními kanály (126, 127D) pro normalizaci.

Čistění a příprava:

• Mixed-mode SPE a DVB SPE desalting před obohacením.
• Fe-NTA magnetické kuličky (High-Select Fe-NTA Magnetic Beads) pro obohacení fosfopeptidů; optimální poměr 1 µg kuliček na 50 µg peptidového inputu (1:50, w/w).
• Offline vysoké-pH reverzní-fázová frakcionace (Pierce High pH Reversed-phase kit) do 8 frakcí pro snížení komplexity.

LC-MS nastavení:

• Thermo Vanquish Neo UHPLC, 50 cm EASY-Spray C18 kolona, gradient 2–28 % ACN/0.1 % FA přes 120 min, 300 nL/min.
• Thermo Orbitrap Eclipse Tribrid MS: FT-MS1 120k (400–1400 m/z); HCD FT-MS2 (NCE 36–40) s RP 90k nebo TurboTMT 50k; 3 s DDA cyklus; 60 s dynamic exclusion.

Analýza dat:

• Proteome Discoverer 3.3 se SEQUEST HT; UniProt human DB; modifikace: carbamidomethyl (C, statická), oxidace (M, dynamická), fosforylace (S,T,Y, dynamická), TMTpro (N-term, K, statická).
• FDR 1 % pomocí Percolator; reporter iony integrovány v 11 ppm okně; normalizace přes kontrolní kanály a globální škálování.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčová pozorování:

• Enrichment: High-Select Fe-NTA magnetické kuličky dosahují vysoké účinnosti a specifity (≥90 % phosphospecificity) při širokém rozsahu vstupů (10–150 µg peptidek). Pro TMTpro-labeled vzorek byla dosažena ~89.9 % specifita.
• Citlivost a hloubka: Kombinace obohacení a vysokého-pH frakcionování vedla k identifikaci a kvantifikaci přibližně 5000 fosforylovaných proteinů napříč vzorky; frakcionace zvýšila identifikace fosfopeptidů a proteinů o ~88 % oproti neo-frakcionovanému obohacení.
• Robustnost proti vstupní hmotnosti: Počet identifikovaných fosfopeptidů zůstal konzistentní v rozmezí 25–150 µg vstupu při udržení vysoké phosphospecificity.
• Kvantifikace napříč vzorky: TMTpro 32plex umožnil relativní kvantifikaci a srovnání fosfoproteomů šesti buněčných linií; byly detekovány buněčně-specifické změny v fosforylaci u proteinů relevantních v onkologii (např. ALDH1A1, MAOA, RERG, AKAP12, VIM, IQGAP2).

Diskuse praktických aspektů:

• Optimální bead-to-sample poměr (1:50) zajišťuje vysokou účinnost při relativně nízkých nákladech na spotřební materiál a umožňuje škálování pro vysokopropustné formáty včetně automatizace.
• Frakcionace do 8 frakcí představuje rozumný kompromis mezi hloubkou analýzy a časově/instrumentálně náročným provozem.
• Použití kontrolních referenčních kanálů (pooled) zlepšuje mezi-run normalizaci a soudržnost kvantifikace ve velkých multiplexních sadách.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy pro laboratoře a výzkum:

• Vysoká propustnost: 32plex štítkování umožňuje paralelní analýzu mnoha stavů či podmínek ve stejném běhu, s úsporou času a nákladů.
• Vysoká specifita obohacení: Fe-NTA magnetické kuličky poskytují rychlé, reprodukovatelné a snadno automatizovatelné obohacení fosfopeptidů.
• Široké použití: workflow je vhodný pro srovnávací studie signálních cest v nádorové biologii, biomarker discovery, farmakologické studie a screening účinků inhibitorů kináz.
• Kompatibilita se standardními softwarovými nástroji pro identifikaci, lokalizaci fosfositisek a kvantifikaci (Proteome Discoverer, SEQUEST, Percolator).

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné směry dalšího vývoje:

• Přechod na datově nezávislou akvizici (DIA) nebo hybridní strategie s real-time search pro zvýšení pokrytí a kvantitativné přesnosti.
• Další zlepšení enrichment chemistrie a multi-enrichment strategií (TiO2 + Fe-NTA) pro lepší zachycení různých typů fosforylací.
• Automatizace manipulace s magnetickými kuličkami pro zvýšení reproducibility v klinických nebo velkoobjemových projektech.
• Rozvoj metod pro redukci potlačení izobarických štítků (ratio compression) a využití vyšší rezoluce/rychlosti detekcí (TurboTMT režimy).
• Směry k single-cell phosphoproteomice a integraci s víceomickými daty prostřednictvím strojového učení pro lepší interpretaci signálních sítí.

Závěr

Prezentovaný workflow kombinuje TMTpro 32plex štítkování, Fe-NTA magnetické obohacení a vysokopH frakcionaci s vysokorozlišovacím Orbitrap MS, čímž poskytuje vysoce propustnou, citlivou a kvantitativně robustní platformu pro studium fosfoproteomiky ve více vzorcích současně. Metoda dosahuje vysoké phosphospecificity (≥90 %), reprodukovatelné hloubky (>~5000 fosforylovaných proteinů s frakcionací) a je vhodná pro studií signalizace v onkologii i pro širší aplikace v biomedicínském výzkumu.

Reference

Frost D., Flora A., Foster L., Jensen P., Patel B., Bomgarden R. High-throughput, multiplexed phosphoproteomics with Fe-NTA magnetic beads enrichment and TMTpro 32plex quantification on Orbitrap Tribrid MS. Thermo Fisher Scientific application note PO004677-2026-EN, 2026.