Utilizing the New Xevo™ TQ Absolute XR Mass Spectrometer for the LC-MS/MS Analysis of Serum Estrogens for Clinical Research

Význam tématu

Analytické stanovení nízkých koncentrací cirkulujících estrogenů (17β-estradiol, E2 a estron, E1) je zásadní pro klinický výzkum endokrinologie, reprodukční medicíny a monitorování hormonálních terapií. Přesné a selektivní metody s nízkou hranicí kvantifikace jsou nutné zejména tam, kde imunochemické testy selhávají v citlivosti nebo selektivitě. Metoda LC-MS/MS bez derivatizace s jednoduchou přípravou vzorku dovoluje získat robustní, kvantitativní údaje z malého objemu séra.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo demonstrovat analytickou citlivost, přesnost a robustnost nové hmotnostní spektrometrické platformy Xevo TQ Absolute XR v kombinaci s UHPLC pro kvantifikaci E2 a E1 v séru pro potřeby klinického výzkumu. Studie prezentuje jednoduchý liquid/liquid extrakční postup, chromatografické rozlišení látek a výkon metody včetně parametrů kalibrace, přesnosti, citlivosti a porovnání s mezilaboratorním EQA schématem (UK NEQAS).

Použitá metodika a instrumentace

Klíčové prvky metodiky:

• Vzorek: 250 µL séra (MSG4000 stripped serum jako surrogátní matrix).
• Interní standard: stabilně značené izotopické interní standardy (13C3).
• Extrakce: liquid/liquid extrakce přidáním 1 mL hexan:ethylacetát (85:15 v/v), míchání 10 min, centrifugace 12 000 g 2 min; 700 µL organické vrstvy se odpaří a resuspenduje v 20 µL methanolu + 30 µL vody.
• Chromatografie: Waters CORTECS Phenyl column, 50 mm, T = 50 °C; mobilní fáze voda/methanol s ammonium fluoride; gradient s celkovým během 4.75 min a cyklem injekce ~5.75 min.
• Detekce: LC-MS/MS v režimu MRM s negativní ESI; kapilární napětí 2.2 kV; rozlišení MS1 a MS2 nastaveno na 0.7 FWHM; kvantifikátor a kvalifikátor pro každou složku.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC I-Class FL (Waters) – UHPLC systémy pro separaci.
• Xevo TQ Absolute XR Mass Spectrometer (Waters) – trojitě kvartapólový MS se StepWave XR ion guide a XDR (eXtended Dynamic Range).
• CORTECS Phenyl kolona (Waters).

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky metody ukazují vysokou linearitu, reprodukovatelnost a velmi nízké limity kvantifikace pro klinické účely:

• Kalibrační rozsahy: E2 2–1000 pg/mL; E1 1–1000 pg/mL; korelační koeficienty r2 > 0.999.
• Přesnost a preciznost: within-run i celková přesnost ≤ 3.2 % CV pro QC na nízké, střední a vysoké úrovni (3.0, 10.0, 700 pg/mL).
• Analytická citlivost (LLOQ): pro E1 bylo dosaženo LLOQ 1.0 pg/mL (při %CV ≤ 20 a bias ≤ 15 %), pro E2 byla z praktických důvodů zvolena LLOQ 3.0 pg/mL (i když 1 pg/mL bylo rozlišitelné od blanku, S/N ptp < 10:1 pro E2 při 1 pg/mL).
• Matrix efekt: studie na šesti jedincích ukázaly určité potlačení/zesílení signálu, které bylo účinně kompenzováno použitím interních standardů.
• Validace přesnosti: analýza 39 UK NEQAS E2 vzorků vykázala vynikající shodu s EQA trimmed means (Deming fit y = 1.17 + 1.012x; Bland–Altman průměrná odchylka −2.50 %).

Diskuse: Kombinace StepWave XR ion guide a XDR zvyšuje citlivost a rozšířený dynamický rozsah, což umožňuje kvantifikaci estrogenních steroidů přes více dekád koncentrací bez derivatizace a při malém objemu vzorku (250 µL). Metoda je vhodná pro klinické výzkumné aplikace vyžadující nízké LLOQ a vysokou selektivitu.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost měřit nízké koncentrace E2 a E1 relevantní pro perimenopauzu, androgen-deprivované stavy nebo pediatrické populace.
• Jednoduchá liquid/liquid extrakce bez nutnosti derivatizace zkracuje přípravu a snižuje riziko artefaktů.
• Nízký objem vzorku (250 µL) umožňuje použití u omezených vzorků.
• Vysoká přesnost a dobrá shoda s externím EQA podporují použití v klinickém výzkumu a referenčních laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace pro zlepšení S/N pro E2 při extrémně nízkých hladinách (např. pokročilé ionizační režimy nebo koncentrační kroky) by mohla posunout LLOQ blíže k 1 pg/mL bez derivatizace.
• Rozšíření panelu o metabolity estrogenů (konjugáty, hydroxy- a metoxy-deriváty) pro farmakokinetické a metabolomické studie.
• Implementace přístupu XDR/StepWave na rutinní klinické platformy pro zajištění konzistentního výkonu přes široký dynamický rozsah.
• Možnost kombinace s automatizovanou přípravou vzorků pro zvýšení throughputu v EQA a velkých klinických studiích.

Závěr

Xevo TQ Absolute XR v kombinaci s ACQUITY UPLC I-Class poskytuje citlivou, přesnou a robustní LC-MS/MS metodu pro kvantifikaci 17β-estradiolu a estronu v séru s minimální přípravou vzorku a bez derivatizace. Metoda dosahuje dobré linearity, vynikající preciznosti a vhodné analytické citlivosti (E2 LLOQ 3 pg/mL; E1 LLOQ 1 pg/mL) při malé spotřebě vzorku a prokazuje soulad s referenčním EQA schématem.

Reference

1. Farrell D., Hammond G., Wardle R. Utilizing the New Xevo TQ Absolute XR Mass Spectrometer for the LC-MS/MS Analysis of Serum Estrogens for Clinical Research. Waters Corporation; May 20, 2026. Application Brief.