Analysis of Serum Estrogens by UPLC-MS/MS for Clinical Research

Význam tématu

Klíčové estrogeny 17 β-estradiol (E2) a estron (E1) hrají zásadní roli v reprodukční fyziologii a hormonálních onemocněních.
Spolehlivé a citlivé stanovení nízkých koncentrací těchto hormonů je nepostradatelné v klinickém výzkumu i v rámci studie endokrinních poruch.

Cíle a přehled studie / článku

Účelem prezentované metody bylo vyvinout rychlý a citlivý postup extrakce a analýzy E2 a E1 v lidské séru bez nutnosti derivatizace.
Metoda využívá UPLC-MS/MS k dosažení nízké meze stanovitelnosti (LLoQ) 3 pg/mL pro E2 a 2 pg/mL pro E1 při objemu vzorku 250 µL.
Studie zahrnuje validaci výkonu metody z hlediska přesnosti, opakovatelnosti, linearity, selektivity i odolnosti vůči matrickým vlivům.

Použitá metodika a instrumentace

Postup přípravy vzorku:

• Do 250 µL séra přidání 20 µL vnitřního standardu ([13C3]-E2, [13C3]-E1).
• Extrahování přidáním 1 mL hexan:ethylacetát (85:15), homogenizace a následná centrifugace.
• Odběr 700 µL organické fáze, odpaření a reekonalizace v 20 µL methanolu a 30 µL vody.

Chromatografické podmínky:

• UPLC kolona CORTECS Phenyl 2.7 µm, 2.1×50 mm.
• Gradientní eluční režim se 0,05 mM amonnou fluoridovou solí a methanolem, průtok 0,3 mL/min, teplota 50 °C, doba analýzy 4,75 min.

Hmotnostní spektrometrie:

• Xevo TQ-XS v režimu ESI(-) a MRM.
• Prekurzorové a produktové ionty pro kvantifikaci a kvalifikaci E2, E1 a jejich vnitřních standardů.

Instrumentace:

• Waters ACQUITY UPLC I-Class (FTN) System
• Waters CORTECS Phenyl Column
• Waters Xevo TQ-XS Mass Spectrometer
• MassLynx Software s TargetLynx XS

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje celkové opakovatelnosti a přesnosti ≤ 4,8 % CV při koncentracích 10–750 pg/mL pro oba analyty.
LLoQ byl určen na 3 pg/mL (E2) a 2 pg/mL (E1) při požadavku RSD ≤ 20 % a poměru signál/šum ≥ 10:1.
Linearita je deklarována v rozsahu ~0,4–1117 pg/mL (E2) a ~0,6–1113 pg/mL (E1) s r2 > 0,998.
Testy specificity pro běžné endogenní interferenty (albumin, bilirubin, lipidy, atd.) vykázaly zotavení v rámci ± 15 %.
Studie matrických efektů na šesti dárcích ukázala variabilitu kompenzovanou použitím vnitřních standardů.
Porovnání s referenčními programy CDC E2 Phase 1 a UK NEQAS potvrdilo výbornou korelaci (r > 0,997, demingovy regrese bez významné konstantní nebo proporcionální odchylky).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda vyžaduje pouze 250 µL vzorku a nevyžaduje derivatizaci, což zjednodušuje workflow a zkracuje dobu přípravy.
Vysoká citlivost a selektivita umožňují spolehlivé sledování hormonálních hladin v klinických vzorcích s nízkými koncentracemi.
Metoda je vhodná pro výzkum endokrinních poruch, farmakokinetické studie a monitorování terapie.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace plně automatizované přípravy vzorků za účelem zvýšení reproducibility a throughput.
Rozšíření panelu měřených hormonů a metabolitů pro komplexní endokrinní profily.
Využití pokročilých datových analýz a umělé inteligence pro interpretaci výsledků v reálném čase.
Vývoj miniaturizovaných a přenosných zařízení pro rychlou analýzu v terénu či point-of-care.

Závěr

Vyvinutá UPLC-MS/MS metoda pro stanovení E2 a E1 v séru kombinuje nízký objem vzorku, jednoduchou extrakci a vysokou analytickou výkonnost.
Metoda prokázala výbornou přesnost, citlivost, linearitu a odolnost vůči maticovým interferencím.
Je optimalizovaná pro klinický výzkum a může být základem pro další rozvoj endokrinních analýz.