Denaturing SEC-MS Analysis of High Molecular Weight Impurities in the GLP-1a Lipopeptides Semaglutide and Tirzepatide

Význam tématu

Analýza vysokomolekulárních nečistot (HMWS) v terapeutických lipopeptidech GLP‑1 (semaglutid, tirzepatid) je kritická pro bezpečnost, stabilitu a kvalitu léčivých přípravků. Lipopeptidové deriváty vykazují zvýšenou tendenci k samoasociaci a ke vzniku jak nekovalentních oligomerů, tak k tvorbě potenciálně kovalentních aduktu/konjugátů. Robustní analytické postupy, které poskytují jak separační informace, tak přesnou hmotnostní identifikaci, jsou nezbytné pro detekci nízkoodstotních HMWS, určení jejich povahy (dimer/trimer vs. modifikovaná/truncovaná forma) a pro podporu rozhodování ve vývoji formulací a kontrolách kvality.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo demonstrovat metodiku denaturující SEC spojenou s vysokorozlišujícím hmotnostním spektrometrem (dSEC‑HRMS) pro charakterizaci nízkokoncentrovaných, ne-dissociovatelných HMWS v preparátech semaglutidu a tirzepatidu. Studie ověřila použitelnost sloupce ACQUITY Premier SEC 125 Å (1.7 µm, 4.6 × 150 mm) a Xevo G3 Q‑ToF ESI MS pro získání intaktních hmotností separovaných variant a současnou kvantifikaci vztahové abundace HMWS pomocí UV (A280).

Použitá metodika a instrumentace

Krátce o postupu:

• Vzorky: komerční formulace - semaglutid (Ozempic®) 1.34 mg/mL a tirzepatid (Zepbound®) 10 mg/mL, analyzované po datu expirace.
• Separační podmínky: mobilní fáze 0.05 % TFA v 55 % acetonitrilu, průtok 0.20 mL/min, teplota kolony 45 °C, vzorková teplota 6 °C, detekce UV při 280 nm.
• Typ separace: denaturující SEC s cílem rozrušit nepevné interakce a identifikovat formy, které se za těchto podmínek nerozpadnou (označeno jako „non‑dissociable“ HMWS).
• Detekce MS: Xevo G3 Q‑ToF, ESI, scan 500–3500 m/z, scan time 0.5 s, kolizní energie minimální (6 V), capillary 2.20 kV, desolvation 350 °C. Data zpracovány v UNIFI/waters_connect.

Použitá instrumentace (samostatná sekce):

• ACQUITY UPLC System (BSM, FTN Sample Manager)
• ACQUITY TUV detektor (280 nm)
• ACQUITY Premier SEC 125 Å, 1.7 µm, 4.6 × 150 mm (MaxPeak Premier)
• Xevo G3 Q‑ToF Mass Spectrometer s ESI zdrojem
• Softwarové nástroje: UNIFI a waters_connect (datové akvizice a dekonvoluce, BayesSpray)

Hlavní výsledky a diskuse

Hlavní zjištění:

• Monomerní hmotnosti: naměřené intaktní hmotnosti monomerů semaglutidu a tirzepatidu odpovídaly očekávaným hodnotám (~4113.58 Da pro semaglutid a ~4813.53 Da pro tirzepatid).
• Semaglutid: pozorovány dvě HMWS špičky (označeny HMWS1 a HMWS2) s retenčními časy odpovídajícími přibližně dimeru a trimru. Průměrné relativní abundancí byly ~2.6 % pro HMWS1 (dimer) a ~0.17 % pro HMWS2 (trimer). U HMWS2 byla zjištěna významná delta‑hmotnost; konkrétně jedna komponenta (HMWS2‑1) vykazovala dekonvoluovanou hmotnost 11649.28 Da, což je o ~691.46 Da méně, než by odpovídalo plnému trimru, což indikuje přítomnost významně truncované peptideové formy.
• Tirzepatid: zaznamenány dva blízké HMWS píky (HMWS1a a HMWS1b) s elucí odpovídající dimeru a velmi nízkými relativními abundancemi (~0.06 % a ~0.07 %). U jedné detekované formy (HMWS1a‑1) byla naměřena hmotnost 7903.16 Da, což je o ~1723.86 Da nižší než očekávaný dimer – opět signál truncace nebo jiné významné modifikace.
• U některých HMWS byly pozorovány významné odchylky hmotností od očekávaných hipotetických bezmodifikačních oligomerů; jednoduché post‑translační crosslinky typu W–W nebo W–Y by vedly naopak k drobným posunům (~‑2 Da), které nebyly zjištěny.

Interpretace a omezení:

• Data ukazují, že dSEC‑HRMS spolehlivě detekuje a poskytuje intaktní hmotnostní informace o nízkoodstotních, ne‑dissociovatelných HMWS, včetně identifikace truncací či heterogenity v oligomerních vrstvách.
• Nicméně metoda samotná neprokazuje definitivně kovalentní vazby; označení „non‑dissociable“ indikuje jen odolnost vůči použitým denaturujícím podmínkám. Definitivní strukturní přiřazení vyžaduje doplňující experimenty (proteolytická štěpení, LC‑MS/MS, top‑down/middle‑down MS, crosslinking‑MS, případně orthogonální techniky jako SEC‑MALS nebo redukční/oxidační testy).

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy uvedené metodiky:

• Citlivá detekce nízkokoncentrovaných HMWS (<0.1–2 %), relevantní pro kontroly kvality a stabilitní studie lipopeptidových formulací.
• Současná získaná intaktní hmotnost usnadňuje rozlišení mezi oligomerizací a truncací/modifikací peptidu.
• UV (A280) detekce integrovaná s SEC poskytuje jednoduchou a lineární metodu pro relativní kvantifikaci HMWS a pro odhad koncentrace monomeru v matricích, kde jiné kvantifikační přístupy nejsou vhodné.
• Možnost analyzovat formulované vysokokoncentrované vzorky bez nutnosti rozsáhlé preparativní úpravy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Navrhované směry dalšího rozvoje a aplikace:

• Integrované workflows kombinující dSEC‑HRMS s cíleným MS/MS a peptidovou proteolýzou pro přesnou lokalizaci truncací a modifikací.
• Použití vyššího rozlišení nebo instrumentů schopných top‑down analýzy pro mapování kovalentních vazeb a aduktů.
• Rozšíření komplementárních metod (SEC‑MALS, AUC, native MS) pro kvantifikaci a potvrzení oligomerních stavů v nativních i denaturovaných podmínkách.
• Vývoj specializovaných SEC kolonek a optimalizace mobilních fází pro zlepšení separace lipopeptidové heterogenity bez podpory modifikací během analýzy.
• Implementace validovaných A280 standardů/kalibrací pro přesnější kvantitativní monitorování monomeru a HMWS v rutinních kontrolách kvality.

Závěr

dSEC‑HRMS použitý se sloupcem ACQUITY Premier SEC 125 Å a Xevo G3 Q‑ToF umožnil citlivou detekci a intaktní hmotnostní charakterizaci nízkoodstotních, ne-dissociovatelných HMWS v komerčních formulacích semaglutidu a tirzepatidu. Metoda identifikovala dimerové a trimerové formy a odhalila významné truncace u některých HMWS. Pro definitivní strukturální určení je však zapotřebí další analytiky (MS/MS, proteolýzy, orthogonální techniky). dSEC‑HRMS tak představuje hodnotný nástroj pro screening a podporu hloubkové charakterizace HMWS v lipopeptidových léčivech.

Reference

1. Zhang X, Kenrick S, Chen M. Identification of GLP‑1 analog oligomeric states using SEC‑MALS. Waters Application AN1901, 2025.
2. Nugrahadi PP, Hinrichs WL, Frijlink HW, Schöneich C, Avanti C. Designing Formulation Strategies for Enhanced Stability of Therapeutic Peptides in Aqueous Solutions: A Review. Pharmaceutics. 2023;15(3):935.
3. Engelund DK, Jensen SS, Lundqvist J. Stable Semaglutide Compositions and Uses Thereof. U.S. Patent Application 17/288,128, 2021.
4. Wuthrich P, Koza SM, Shiner S. Advancing Analysis of Covalent High Molecular Weight Insulin With ACQUITY Premier SEC 125 Å Columns. Waters Application Note, 720008660, 2025.
5. Bellmaine S, Schnellbaecher A, Zimmer A. Reactivity and Degradation Products of Tryptophan in Solution and Proteins. Free Radical Biology and Medicine. 2020;160:696–718.