Direct and Rapid SEC Analysis of Monoclonal Antibody Titer and Aggregation in Cell- Culture

Význam tématu

Analýza titru a agregace monoklonálních protilátek (mAb) přímo v bioreaktorových vzorcích je klíčová pro optimalizaci buněčných linií, sledování kvality procesu a urychlení vývoje biotechnologických produktů. Tradiční metody vyžadují Protein A purifikaci, která může pozměnit úroveň agregátů a prodloužit čas analýzy. Rychlá SEC‐FLR metoda umožňuje přímou detekci mAb monomeru a agregátů v buňkami vyčištěných médiích během několika minut bez nutnosti čištění.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout vysokopropustnou SEC metodu trvající 2,4 minuty, schopnou kvantifikovat titer a vysokomolekulární agregáty (HMWS) monoklonálních protilátek přímo ve vzorcích z CHO buněčných kultur. Metoda využívá intrinsickou fluorescenci pro zvýšení citlivosti a minimalizaci objemu injekce, přičemž se testovala robustnost a životnost kolony při více než 500 po sobě jdoucích analýzách.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky protilátek (trastuzumab, Kanjinti) byly ředěny v PBS nebo ne-transfekovaném CHO médiu (NTM), filtrovaném 0,2 μm a odstředěném. Analýzy probíhaly na systému Waters ACQUITY Premier UPLC s Quaternary Solvent Manager a CH-A termostatem:

• Kolona: XBridge Premier Protein SEC 250 Å, 2,5 μm, 4,6×150 mm (BEH-PEO částice, MaxPeak HPS hardware)
• Mobilní fáze: 200 mM ammonium acetát, LC-MS grade, sterilně filtrovaná 0,1 μm
• Detekce: TUV (280 nm) a FLR (ex 280 nm/em 350 nm), autozero v 0,6 min
• Teplota kolony: 25 °C, teplota vzorku: 6 °C
• Průtok: 1,0 mL/min, objem injekce: 0,1 μL (FLR) nebo 1,0 μL (UV)
• Software: Empower 3

Hlavní výsledky a diskuse

Intrinsic FLR detekce zvýšila poměr signál/šum pro HMWS více než desetkrát oproti A280, umožnila snížit objem vzorku na 0,1 μL a odstranit interferenci DNA/RNA. Kvantifikace titru protilátek byla lineární v rozmezí 0,25–4 mg/mL s odchylkou ≤3,2 %. Dimer HMWS1 byl spolehlivě detekovatelný již od 1 % abundance při 0,5 mg/mL titru. Stresované vzorky prokázaly lineární nárůst multimerních agregátů (HMWS2) od 1,5 % úrovně. Kolona si zachovala rozlišení (Rs ≥1,5) více než po 500 injekcích, odhadovaná životnost bez strážné kolony přesahuje 1000 analýz. Vzorky lze dále ředit (až 1:1 s PBS) pro omezení kontaminace a prodloužení životnosti kolony.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Rychlý monitoring titru a agregace během kvašení
• Eliminaci Protein A purifikace, snížení rizika artefaktů
• Vysokou propustnost (2,4 minuty na analýzu)
• Minimální objem vzorku (0,05–0,1 μL)
• Robustní výkon pro průmyslovou QA/QC a vývoj procesů

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může zahrnovat využití strážných kolonek pro další ochranu SEC kolony, automatizované 2D‐LC systémy, šíření na jiné biologické molekuly (fúzní proteiny, ADC), integraci direct coupling s MS a miniaturizaci pro mikroPRC. Rozšíření metodologie na on-line monitorování procesů (PAT) umožní real-time kontrolu kvality.

Závěr

Vyvinutá SEC‐FLR metoda přináší rychlou a citlivou analýzu titru a agregace mAb přímo v buněčných kádích bez nutnosti předchozí purifikace. Spojení 200 mM AMA mobilní fáze, hydrofobně-hydrofobního povrchu kolony a intrinsické FLR detekce zajišťuje vysoké S/N, minimální objemy vzorku a dlouhou životnost kolony, což usnadní rychlé rozhodování v bioprocesním výzkumu a výrobě.

Reference

1. Dunn ZD, Desai J, Leme GM, Stoll DR, Richardson DD. Rapid Two-Dimensional Protein-a Size Exclusion Chromatography of Monoclonal Antibodies for Titer and Aggregation Measurements From Harvested Cell Culture Fluid Samples. MAbs. 2020;12(1):1702263.
2. Paul AJ, Schwab K, Hesse F. Direct analysis of mAb aggregates in mammalian cell culture supernatant. BMC Biotechnology. 2014;14(1):1–11.
3. Koza SM, Jiang AHW, Yu YQ. Rapid SEC-UV Analysis of Monoclonal Antibodies Using Ammonium Acetate Mobile Phases. Waters Application Note 720007852, 2023.