dSEC and dSEC-HRMS Characterization of GLP-1a and Related Peptide Therapeutics

Význam tématu

Analytika terapeutických peptidů (zejména GLP-1 analogů jako semaglutid a tirzepatid) je klíčová pro zajištění bezpečnosti a účinnosti lékových přípravků. Peptidové API mají vysokou afinitu k povrchům a sklon k tvorbě disociovatelných i nedisociovatelných oligomerů, což komplikuje velikostně orientované separace. Spolehlivá detekce a charakterizace nízkoabundantních vysokomolekulárních nečistot (HMWS) je nezbytná pro kontrolu kvality, stabilitu a formulaci peptidových léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Autoři prozkoumali použití denaturačních mobilních fází kombinovaných s vysoce inertními a efektivními SEC kolónami (označeno dSEC) pro separaci nedisociovatelných HMWS u GLP-1 analogů. Cílem bylo ukázat, že dSEC poskytuje lepší separaci a obnovu HMWS a že kombinace s vysokorozlišovacím hmotnostním spektrometrem (dSEC-HRMS) umožní identifikovat a charakterizovat nízkoabundantní oligomerické formy v přípravcích tirzepatidu a semaglutidu.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda využívá sekvenční přístup: denaturační SEC separace následovaná HRMS charakterizací. Klíčové prvky:

• LC systém: ACQUITY Premier System s BioSample Manager (FTN) a BioQuaternary Solvent Manager (QSM).
• SEC kolony: MaxPeak Premier SEC (125 Å, 1.7 µm, 4.6 x 150 mm) a MaxPeak Premier SEC 250 Å pro širší rozsah; porovnávací SEC 120 Å, 1.9 µm, 4.6 x 150 mm.
• Povrchová technologie: MaxPeak HPS (hydrophilic surface) snižující sekundární interakce a zlepšující obnovu HMWS.
• Detekce: TUV/UV detektor (např. 276–280 nm) s 5 mm titanovou flow cell; MS: Xevo G3 Q-ToF (vysoké rozlišení).
• Mobilní fáze (příklad denaturační): 1 g/L arginin / acetonitril / ledová kyselina octová v poměru 65/20/15 (v/v/v). Jiné podmínky uváděny: 0.05% TFA, 55% MeCN, teplota 45 °C pro specifické běhy.
• Parametry LC/MS: průtok 0.4 mL/min, objem injekce ~3.5 µL, teplota kolony 25 °C; MS rozsah m/z 500–3500; zdrojová teplota 120 °C, desolvační 350 °C, capilární napětí ~2.2 kV, sample cone 20 V, cone gas 35 L/h, desolvation gas 600 L/h.

Hlavní výsledky a diskuse

Hlavní zjištění studie zahrnují:

• dSEC umožnilo rozdělení monomeru od dimerů a vyšších oligomerů i u nízkoabundantních, nedisociovatelných HMWS v semaglutidu a tirzepatidu.
• Porovnání kolonek ukázalo, že ACQUITY/MaxPeak Premier 125 Å s MaxPeak HPS výrazně redukuje sekundární interakce a vede ke zlepšené obnově HMWS (uváděno až ~2× zlepšení v porovnání s komparativní kolonkou).
• Analýzou hmotností bylo identifikováno několik diskrétních oligomerických forem: měřené hodnoty zahrnovaly typické hmotnosti odpovídající monomeru (~4113.6 Da), dimeru (~8227.2 Da) a trimeru (~12340.7 Da), dále byly detekovány další HMWS signály v rozmezí přibližně 9609–9640 Da a vyšší formy až ~14440.6 Da. Tyto měřené hmoty indikovaly přítomnost konkrétních, nedisociovatelných asociátů.
• Chromatografické průběhy a celkové plochy píků ukázaly, že u porovnávací kolony docházelo k částečnému ko-elutování HMWS s monomerem v důsledku sekundárních interakcí, zatímco MaxPeak Premier kolona separaci očistila a zúžila šířku píků.
• Relativní množství HMWS v analyzovaných příkladech bylo nízké (řád <1 %), nicméně díky kombinaci dSEC a HRMS byly tyto nízkoabundantní formy spolehlivě detekovány a charakterizovány.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické dopady a přínosy dSEC-HRMS pro analytiku peptidů:

• Zvýšená schopnost detekovat a kvantifikovat nízkoabundantní a nedisociovatelné agregáty, které mohou ovlivnit bezpečnost a stabilitu léčiva.
• Redukce sekundárních interakcí pomocí povrchově upraveného hardware zlepšuje přesnost a obnovu HMWS, čímž se sniží riziko podhodnocení agregátů během QC testů.
• Metoda umožňuje rozlišení dimerických a vyšších oligomerických forem, což pomáhá v charakterizaci mechanismů agregace a při vývoji formulací a stabilizačních přístupů.
• Vysoké rozlišení MS poskytuje informaci o nesouvisejících modifikacích (např. nekovalentní asociace, varianty s rozdílnou hmotností), což je klíčové pro forenzní identifikaci nečistot.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje a aplikace:

• Integrace dSEC-HRMS do rutinních QC workflow pro peptidová léčiva, zejména pro nové biologické modality citlivé k agregaci.
• Další optimalizace mobilních fází a povrchových úprav kolón s cílem ještě více minimalizovat sekundární interakce pro šíři peptidových a proteinových analytů.
• Rozšíření rozsahu detekce k multi-analytickým formulacím a kombinovaným terapiím včetně aplikací pro biosimilars a stabilitní studie při dlouhodobém skladování.
• Propojení s technikami jako SEC-MALS nebo ion-mobility MS pro kvantitativní a strukturní určení oligomerů a konformací v řešení.

Závěr

Studie demonstruje, že použití denaturačních mobilních fází spolu s inertními, povrchově upravenými SEC kolónami (dSEC) významně zlepšuje separaci a obnovu nedisociovatelných HMWS u GLP-1 analogů. Kombinace s HRMS (dSEC-HRMS) poskytuje hodnotné informace o nízkoabundantních oligomerických formách, které by jinak mohly zůstat nepovšimnuty. Tento přístup zvyšuje analytickou přesnost v charakterizaci peptidových léčiv a představuje užitečný nástroj pro vývoj a kontrolu kvality.

Reference

1. Wuthrich P., Koza S. M., Shiner S. J. dSEC and dSEC-HRMS Characterization of GLP-1a and Related Peptide Therapeutics. Waters Corporation, Milford, MA, 2026.
2. Denaturing SEC-MS Analysis of High Molecular Weight Impurities in the GLP-1a Lipopeptides Semaglutide and Tirzepatide. Literature Code 720009256. Waters Corporation.
3. Advancing Analysis of Covalent High Molecular Weight Insulin With ACQUITY Premier SEC 125 Å Columns. Literature Code 720008660. Waters Corporation.
4. Development of Separation Methods for GLP-1 Synthetic Peptides Utilizing a Systematic Protocol and MaxPeak High Performance Surface Technology. Literature Code 720008267. Waters Corporation.
5. Zhang X., et al. Identification of GLP-1 analog oligomeric states using SEC-MALS. Wyatt Technology Application Note AN1901, 2025.
6. Waters Corporation. Poster/Material reference 720009452EN. 2026.