Reversed-Phase LC-MS Analysis of Low- Abundance Impurities in a GLP-1a Therapeutic Using a Charged Surface 230Å Superficially Porous Phenyl-Hexyl Column

Význam tématu

Charakterizace stopových nečistot v lipopeptidových terapeutikách, jako je GLP-1a tirzepatid, je kritická pro zajištění bezpečnosti, stability a konzistence výroby. Reversed-phase LC spojená s vysokorozlišovacím hmotnostním spektrometrem (RPLC-HRMS) umožňuje citlivé mapování variant a degradačních produktů, které mohou být potlačeny dominancí lipofilního acylového řetězce. Optimalizované chromatografické fáze a adaptéry mobilních fází tak přímo ovlivňují schopnost detekce a identifikace těchto nízkoabundantních variant.

Cíle a přehled studie

Studie prezentuje RPLC-HRMS metody pro profilování stopových nečistot v komerčním roztoku tirzepatidu (Mounjaro). Hlavními záměry byly: posoudit schopnost Waters BioResolve Peptide Phenyl-Hexyl+ RP kolony (SPP 1.6 µm, 230 Å, MaxPeak Premier) při separaci lipopeptidu, porovnat účinek použití 0.10% formiové (FA) versus triflurooctové (TFA) kyseliny v mobilní fázi a ověřit rozlišovací schopnost vůči řadě syntetických impuritních standardů. Dále byla kolona porovnána s alternativní SPP kolonou (2.7 µm, 90 Å).

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Vzorek: komerční tirzepatid (30 mg/mL) ředěný na 3 mg/mL; syntetické standardy několika impurit (L-isoAsp9, L-isoAsp15, C-terminální deamidace, Ile12→Nva, Gln19/Gln24 deamidace, D-Ser32).
• Chromatografie: gradient MeCN 1%/min, průtok 0.30 mL/min, kolona 2.1 x 150 mm, teplota 60 °C, objem injekce 0.5 µL (případně dle potřeby).
• Mobilní fáze: A – voda + 0.10% FA nebo TFA; B – MeCN + 0.10% FA nebo TFA.
• Detekce: UV při 215 nm a HRMS v módu ESI; rozsah m/z 400–2800, doba skenování 0.250 s.

Instrumentace:

• UPLC: ACQUITY UPLC se systémem Binary Solvent Manager, Flow‑Through Needle a TUV detektorem.
• Kolona: Waters BioResolve Peptide Phenyl‑Hexyl+ RP Column, MaxPeak Premier Technology, SPP 1.6 µm, 230 Å, 2.1 x 150 mm (p/n: 186011727).
• Alternativa: SPP kolona 2.7 µm, 90 Å, 2.1 x 150 mm (výrobce neuveden).
• MS: Xevo G3 QTof s ESI zdrojem; nastavení např. zdrojová teplota 120 °C, desolvační 300 °C, kapilární napětí 3.00 kV, cone 20 V, desolvační plyn 750 L/h, scan bez kolizního energie (6 V standby), zpracování dat v UNIFI a waters_connect s BayesSpray dekonvolucí.

Hlavní výsledky a diskuse

Separační a hmotnostně‑spectrometrické výsledky ukázaly:

• Rozsáhlá sada nízkoabundantních variant tirzepatidu byla detekována v obou režimech (FA i TFA). Hlavní nález: Peak 5 identifikovaný jako L‑isoAsp9 měl relativní plošný podíl ~0.33% v FA separaci.
• Další syntetické standardy: L‑isoAsp15 (0.09–0.11%), Gln19 a Gln24 deamidace (eluce po hlavním píku; v TFA byly tyto dvě odděleny, v FA se částečně překrývaly), C‑terminální deamidace pouze jako stopová raménková složka v FA, Ile12→Nva částečně resolvován před hlavním píkem v obou modifikacích; D‑Ser32 nebyl uspokojivě separován pro MS identifikaci.
• Vysoce citlivé HRMS dokázalo přidělit monoisotopické mzdy s přesností lepší než ~6 ppm; hlavní tirzepatidní špička odpovídala předpovězené hmotnosti s odchylkou ~+2.2 ppm.
• Ilustrační je detekce stopového fragmentu s predominantní hmotností 4486.261 při relativní abundanci 0.004–0.005% — ukázka vysoké citlivosti metody. Kvalita MS dat byla obecně lepší v režimu FA, zatímco optická (A215) citlivost byla lepší s TFA.
• Porovnání kolony 230 Å / 1.6 µm versus alternativa 90 Å / 2.7 µm prokázalo lepší chromatografickou detailnost a citlivější detekci s 230 Å kolónou; to koresponduje s vhodnějším větším pórovitým objemem pro ~5 kDa peptid a vyšší účinností menších částic.

Diskuse poukazuje na to, že lipofilní acylový řetězec často dominuje retenci, takže jemné změny v peptidové sekvenci mohou být maskovány a vyžadují jemné ladění gradientu, teploty, ligandové selektivity a možné použití delších kolonn či komplementárních technik.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda nabízí citlivou a selektivní RPLC‑HRMS platformu pro impuritní profilování tirzepatidu a obecně GLP‑1a lipopeptidů.
• Možnost volby FA versus TFA umožňuje optimalizaci mezi maximální MS citlivostí (FA) a lepší UV odezvou (TFA), podle instrumentálních požadavků laboratoře.
• Kolona s nabitou povrchovou úpravou a fenyl‑hexyl ligandem poskytuje odlišnou selektivitu vůči klasickým C18 fázím, což zvyšuje šanci na separaci izomerních či degradačních forem.
• Krátké až středně dlouhé analýzy (např. 46 min pro gradient 1% MeCN/min) se dají použít jako rychlá RP metrika v kombinaci s orthogonálními metodami (HILIC, IEX) nebo jako součást QC toku pro vývoj a šaržové uvolňování.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Pro zvýšení rozlišení se doporučuje experimentovat s delšími kolonnami (např. 300 mm) a jemnějšími gradienty, což může odhalit další blízké impurity.
• Integrace orthogonálních technik (HILIC, ion‑exchange) spolu s RPLC‑HRMS zlepší komplexní pokrytí impuritního profilu.
• Další optimalizace může zahrnovat teplotní režimy, varianty ligandů (fenyl vs C18) a jemné ladění aditiv mobilní fáze pro lepší rozlišení izomerů (např. isoAsp vs Asp, racemáty).
• Pokročilé datové zpracování a dekonvoluce (BayesSpray apod.) zůstane klíčové pro kvantifikaci a identifikaci stopových složek v komplexních matricích.

Závěr

Waters BioResolve Peptide Phenyl‑Hexyl+ (SPP 1.6 µm, 230 Å, MaxPeak Premier) prokázala schopnost vysoce citlivě a selektivně separovat a identifikovat nízkoabundantní impurity tirzepatidu pomocí RPLC‑HRMS. FA a TFA jako modifikátory mobilní fáze nabízejí kompromisy mezi MS a UV citlivostí. Větší póry a menší částice zlepšily výkon vůči alternativní SPP kolóně (90 Å, 2.7 µm). Metoda je vhodná pro detailní impuritní profilování v kontextu vývoje i uvolňování léčiv a bude profitovat z další optimalizace a kombinace s orthogonálními přístupy.

Reference

1. Yang H., Shiner S. Separation of a GLP‑1 Receptor Agonist and Structurally Similar Impurities Using BioResolve™ Peptide Phenyl‑Hexyl+ and C18+ Columns. Application Brief. Waters Corporation. June 2026.
2. Yoshida K., et al. Impurity profiling of synthetic cyclic peptides based on orthogonality between hydrophilic‑interaction and reversed‑phase liquid chromatography. Journal of Chromatography A. 1745 (2025): 465748.
3. Han D., Ippoliti S., Birdsall R. E., Nyholm K. Accelerating Method Development and Manufacturing of GLP‑1 Analogs with LC‑UV/MS. Application Note. Waters Corporation. May 2025.
4. Goyon A. Advanced chromatographic strategies for comprehensive characterization of therapeutic peptides. Keynote, 55th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques (HPLC 2026), Indianapolis IN, USA. 2026.
5. Hanna C. M., Koza S. M., Shiner S. Temperature Dependence on Reversed‑Phase Separations of Fatty Acid Modified GLP‑1 Receptor Agonists and Their Impurities. Application Note. Waters Corporation. October 2024.
6. Koza S. M., Chambers E. E. Selecting a Reversed‑Phase Column for the Peptide Mapping Analysis of a Biotherapeutic Protein. Application Note. Waters Corporation. 2017.