Probe the protein conformation using top-down hydrogen exchange mass spectrometry at higher resolution with electron transfer dissociation

Význam tématu

Studium dynamiky a konformací proteinů na úrovni jednotlivých aminokyselin je klíčové pro pochopení jejich funkce a interakcí.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo optimalizovat podmínky ETD pro HDX-MS s minimálním škrábáním vodíku a aplikovat tuto metodiku na calmodulin v apo- a holo- formě pomocí top-down a bottom-up přístupu v plně automatizovaném HDX workflow.

Použitá metodika

Modelový peptid P1 (HHHHHHIIKIIK) byl plně deuterován v D₂O a sloužil k ladění parametrů, zejména teploty zdroje, přenosového napětí a dalších zdrojových nastavení, aby se minimalizoval deuterový scrambling při zachování citlivosti.
Ve bottom-up workflow byly vzorky po zastavení reakce tráveny a současně analyzovány plným skenem MS a sekundárním ETD MS2. V top-down workflow byly denaturované vzorky přímo elutovány na Orbitrap Ascend pro současný MS a cílené ETD MS2 analýzy.

Použitá instrumentace

Orbitrap Ascend Structural Biology Edition mass spectrometer
Thermo Scientific Vanquish Flex/Binary pump N LC systém
TRAJAN CHRONECT HDX workflow station
C18 trap kolona a Hypersil GOLD C18 analytická kolona pro bottom-up analýzu

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizované podmínky vedly k téměř nulovému deuterovému scramblingu modelového peptidu.
Bottom-up ETD dosáhlo téměř 100% sekvenčního pokrytí calmodulinu, top-down ETD přineslo 88% pokrytí.
Apo-calmodulin systematicky vykazoval vyšší deuterovou inkorporaci než holo-forma, zejména v C-terminální oblasti.
S využitím ETD byla lokalizace deuteria na úrovni jednotlivých fragmentů téměř na úrovni jedné aminokyseliny.

Přínosy a praktické využití metody

• Detailní mapování změn proteinových konformací a vazebních míst.
• Komplementarita top-down a bottom-up přístupů pro úplné pokrytí sekvence.
• Vhodnost pro vysokopropustné automatizované HDX-MS studie protein–ligand interakcí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření metody pro složitější proteinové komplexy a multikomponentní systémy.
Integrace s dalšími nekovenzními dissociačními technikami pro zvýšení rozlišení a citlivosti.
Zavádění paralelních HDX-MS workflow pro zvýšení throughputu ve farmaceutickém výzkumu.

Závěr

Optimalizované HDX-ETD na Orbitrap Ascend Structural Biology Edition poskytuje vysoké rozlišení na úrovni aminokyselin pro studium konformačních změn proteinů. Studie na calmodulinu potvrdila konzistentní rozdíly mezi apo- a holo- formou a potvrdila účinnost metody.

Reference

• Kasper D. Rand, Thomas J. D. Jørgensen, Analytical Chemistry 2007, 79(22), 8686–8693.
• Kasper D. Rand, Martin Zehl, Ole N. Jensen, Thomas J. D. Jørgensen, Analytical Chemistry 2010, 82(23), 9755–9762.