Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry for the masses

Význam tématu

Studium tvaru a dynamiky proteinů a proteinových komplexů je zásadní pro pochopení jejich biologické funkce, interakcí a mechanismů vzniku onemocnění. Tradiční metody jako rentgenová krystalografie, NMR nebo kryo-EM často vyžadují velké množství materiálu, specifické podmínky krystalizace či omezenou velikost analyzovaných biomolekul. Moderní přístupy založené na hmotnostní spektrometrii, zejména hydrogen-deuterium exchange (HDX-MS), nabízejí vysokou citlivost, možnost práce s vyššími molekulovými hmotnostmi a analýzu proteinů v nativních podmínkách.

Cíle a přehled studie

Cílem white paperu je představit princip HDX-MS jako nástroje pro zkoumání konformace, struktury, dynamiky a interakcí proteinů. Text popisuje výhody HDX-MS ve srovnání s tradičními metodami, uvádí klíčové experimentální postupy od přípravy vzorku až po analýzu dat, a demonstruje aplikace na případových studiích: detekce vazebných míst, allosterických změn, intrinsicky disordered region, mechanismů agregace i“pulse-labeling“ experimentů.

Použitá instrumentace

• Orbitrapové hmotnostní spektrometry s vysokým rozlišením a přesnou hmotností
• H/D-X PAL sampler system (LEAP Technologies) pro automatizované štěpení, štěpení na koloně s pepsinem a LC-MS analýzu
• Fragmentační techniky: ETD pro minimalizaci scramble efektu, doplňkově UVPD, HCD, CID či EThcD

Použitá metodika

• Kontinuální i pulsed labelování v deuterovaném pufru v různých časových oknech (od sekund po hodiny)
• Quenching reakce na pH 2,5 a 0 °C pro minimalizaci zpětné výměny
• Bottom-up workflow: štěpení proteinů (řešení v roztoku nebo immobilizovaný pepsin), chytrá LC separace, MS1 a datově dependentní MS2 (ETD) pro lokalizaci deuteria na úrovni jednotlivých peptidů či zbytků aminokyselin
• Intakt/top-down přístup: analýza celých proteinů nebo komplexů po předběžné separaci na C4 kolone, následná fragmentace ETD/UVPD

Hlavní výsledky a diskuse

• HDX-MS poskytuje mapu přístupnosti vodíkových vazeb v páteřích proteinů, odhaluje flexibilní smyčky i stabilní jádro
• Detekce protein-ligand a protein-protein interakcí – lokalizace vazebných míst podle snížené inkorporace deuteria
• Analýza allosterických efektů – změny konformace i v odstavených oblastech proteinu
• Studium intrinsicky disordered region – experimenty při nižším pH umožňují zpřesnit kinetiku rychlých výměn
• Mechanismy proteinové agregace – monitorování postupného nárůstu deuterové inkorporace v agregátech terapeutických protilátek
• Technické pokroky: ultra-vysoké rozlišení Orbitrap, ETD pro minimalizaci scramble, integrace UVPD, automatizované platformy, pokročilý software pro HDX data processing

Přínosy a praktické využití metody

• Komplementární informace k X-ray, NMR a cryo-EM, především pro velké a flexibilní komplexy
• Možnost analýzy proteinů v nativním roztoku, sledování dynamiky v reálných podmínkách
• Uplatnění v biologickém výzkumu, vývoji léčiv, kvalitativní a kvantitativní kontrole bioterapeutik
• Schopnost sledovat allosterii, PTM efekty a strukturované i neuspořádané oblasti jednoho experimentu

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zrychlení a zjednodušení workflow automatizací a “online” systémy
• Pokročilá fragmentační schémata (např. paralelní ETD/UVPD) pro vyšší prostorové rozlišení
• Využití umělé inteligence a strojového učení pro predikci a analýzu komplexních dat HDX-MS
• Integrace s dalšími hybrydními technikami (cross-linking MS, ion-mobility MS, integrativní modelování)
• Rozšíření aplikací pro screening ligandů, výzkum intrinsicky disordered proteinů či podmíněné interakce ve víceproteinových sítích

Závěr

HDX-MS představuje flexibilní a vysoce citlivou techniku pro studium struktury, dynamiky a interakcí proteinů v nativním prostředí. Díky pokroku v oblasti hardware i software se metodika stává stále dostupnější i pro rutinní laboratoře a otvírá nové možnosti v proteinové strukturní biologii, vývoji léčiv a biotechnologii.

Reference

1. Huang, R.Y., Chen, G.: Higher order structure characterization of protein therapeutics by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal Bioanal Chem. 406, 6541–6558 (2014)
2. Rand, K.D., Zehl, M., Jorgensen, T.J.D.: Measuring the hydrogen/deuterium exchange of proteins at high spatial resolution by mass spectrometry: Overcoming gas-phase hydrogen/deuterium scrambling. Acc Chem Res. 47, 3018–3027 (2014)
3. Abzalimov, R.R., Kaltashov, I.A.: Controlling hydrogen scrambling in multiply charged protein ions during collisional activation: Implications for top-down hydrogen/deuterium exchange MS utilizing collisional activation in the gas phase. Anal Chem. 82, 942–950 (2010)
4. Ferguson, P.L. et al.: Hydrogen/deuterium scrambling during quadrupole time-of-flight MS/MS analysis of a zinc-binding protein domain. Anal Chem. 79, 153–160 (2007)
5. Hagman, C. et al.: Inter-molecular migration during collisional activation monitored by hydrogen/deuterium exchange FT-ICR tandem mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. 15, 639–646 (2004)
6. Rand, K.D., Jorgensen, T.J.: Development of a peptide probe for the occurrence of hydrogen (1H/2H) scrambling upon gas-phase fragmentation. Anal Chem. 79, 8686–8693 (2007)
7. Rand, K.D. et al.: Protein hydrogen exchange measured at single-residue resolution by electron transfer dissociation mass spectrometry. Anal Chem. 81, 5577–5584 (2009)
8. Trabjerg, E., Nazari, Z.E., Rand, K.D.: Conformational analysis of complex protein states by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS): Challenges and emerging solutions. Trends Anal Chem. 106, 125–128 (2018)
9. Pan, J. et al.: Characterizing short-lived protein folding intermediates by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Anal Chem. 82, 8591–8597 (2010)
10. Konermann, L., Simmons, D.A.: Protein-folding kinetics and mechanisms studied by pulse-labeling and mass spectrometry. Mass Spectrom Rev. 22, 1–26 (2003)
11. Miranker, A. et al.: Detection of transient protein folding populations by mass spectrometry. Science. 262, 896–900 (1993)
12. Zhang, Z. et al.: Improved protein hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry platform with fully automated data processing. Anal Chem. 84, 4942–4949 (2012)
13. Zheng, J. et al.: Protein dynamics and conformational changes explored by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Curr Opin Struct Biol. 58, 304–313 (2019)
14. Mayne, L. et al.: Many overlapping peptides for protein hydrogen exchange experiments by the fragment separation-mass spectrometry method. J Am Soc Mass Spectrom. 22, 1898–1905 (2011)
15. Goswami, D. et al.: Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. J Am Soc Mass Spectrom. 24, 1584–1592 (2013)