Probe the Protein Conformation using Top-down Hydrogen Exchange Mass Spectrometry at Higher Resolution with Electron Transfer Dissociation

Význam tématu

Důkladné určení konformace bílkovin s rozlišením na úrovni jednotlivých aminokyselin je zásadní pro pochopení mechanizmů proteinových interakcí, stability a funkčních změn po navázání ligandů.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo optimalizovat podmínky pro top-down HDX-MS s disociací ETD tak, aby se minimalizovalo přeskupování vodíkových (deuteriových) izotopů („scrambling“) a dosáhlo se téměř jednoamino kyselinového rozlišení. Jako systém byla zvolena kalmodulinová proteiny ve formách apo a holo.

Použitá metodika a instrumentace

Pro kalibraci nízkého scramblingu byl využit syntetický peptid P1 (HHHHHHIIKIIK) plně deuteriovaný v D2O.

• Tribridní hmotnostní spektrometr Thermo Scientific Orbitrap Ascend Structural Biology Edition
• C18 trap kolona a Hypersil GOLD C18 analytická kolona
• Automatizovaný HDX workflow station pro online míchání a quencher
• ETD optimalizováno nastavením teplot, přenosových napětí a zdrojových parametrů (viz Doporučená nastavení)

Hlavní výsledky a diskuse

1. Scrambling: Měření deuterium obsahu fragmentů c2–c6 potvrdilo velmi nízkou míru scramblingu, srovnatelnou s literaturou.
2. Pokrytí sekvence: Bottom-up ETD MS2 dosáhla téměř 100% pokrytí apo- a holo- kalmodulinu, zatímco top-down ETD poskytla 88% pokrytí.
3. Deuterium uptake: Apo- forma kalmodulinu vykazovala výrazně větší inkorporaci deuteria než holo- forma, zejména v C-terminální oblasti.
4. Rozlišení: Kombinací top-down a bottom-up přístupu bylo dosaženo téměř jednoamino kyselinového rozlišení na N-terminu a částečného rozlišení na C-terminu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Přesnou lokalizaci conformačních změn proteinu při vazbě ligandů či iontů
• Rychlý screening variant proteinů (např. s či bez His-tagu)
• Podporu QA/QC procesů v biotechnologických a farmaceutických laboratořích

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metodiky na větší proteiny a proteinové komplexy
• Integrace s dalšími neergodickými disociačními technikami (ETD/ECD) pro vyšší rozlišení
• Plná automatizace HDX workflow pro vysokopropustné aplikace
• Vývoj nástrojů pro rychlou vizualizaci a kvantifikaci deuterium uptake

Závěr

Optimalizované podmínky top-down HDX-ETD na Orbitrap Ascend minimalizují deuterium scrambling a umožňují detailní mapování konformačních změn na úrovni jednotlivých zbytků. Konzistentní výsledky pro apo- a holo- kalmodulin potvrzují spolehlivost a použitelnost metody v rozličných aplikacích.

Reference

1. Kasper D. Rand and Thomas J. D. Jørgensen, Analytical Chemistry 2007, 79(22), 8686–8693.
2. Kasper D. Rand, Martin Zehl, Ole N. Jensen and Thomas J. D. Jørgensen, Analytical Chemistry 2010, 82(23), 9755–9762.