Breaking Down RNA Stability: Accelerated Aging of Reference Standards with ASAP prime® Modeling

Význam tématu

Přesná a spolehlivá hodnocení stability RNA referenčních materiálů je klíčová pro vývoj analytických metod, zajištění opakovatelnosti výsledků a splnění regulačních požadavků v oblasti oligonukleotidů. Rychlé stanovení trvanlivosti usnadňuje rozhodování o skladování, balení a systémové vhodnosti v laboratořích vývoje i QC.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat použití akcelerovaného testování stability metodou ASAP prime® Modeling pro dvě RNA referenční standardy od společnosti Waters – Lipid-Conjugated ASO LC-MS Standard a siRNA LC-MS Standard. Studie stanovila predikci dlouhodobé trvanlivosti na základě několikatýdenních experimentů při zvýšených teplotách a vlhkostech.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnovala stresování lyofilizovaných vzorků bez obalů v kanystrech s nasycenými solnými roztoky pro kontrolu relativní vlhkosti při teplotách od 25 do 50 °C. Sledovala se ztráta čistoty pomocí HILIC chromatografie.

• Chromatograf: ACQUITY UPLC H-Class System s autosamplerem a Flow-Through Needle
• Kolona: GTxResolve Premier BEH Amide, 300 Å, 1,7 µm, 2,1×100 mm
• Mobilní fáze: acetonitril a 50–100 mmol/l amoniakální acetát dle vzorku
• Teplota kolony: 5 °C pro siRNA, 75 °C pro Lipid-Conjugated ASO
• Detekce: UV při 260 nm, TUV 5 Hz
• Software: Empower Chromatography Data Software pro akvizici a ASAPprime® Modeling (verze 7.0) pro výpočet Arrheniovy závislosti

Hlavní výsledky a diskuse

Oba standardy vykázaly výraznou citlivost na vlhkost. Lipid-Conjugated ASO Standard při 5 °C a nízké vlhkosti (<1 % RH) ztratil 10 % čistoty za šest měsíců, zatímco v mrazicích podmínkách (-20 °C) zůstává stabilní. SiRNA Standard vykázal extrémní citlivost na dehybridaci a následnou degradaci jednotlivých vláken, přičemž model predikuje dvouletou stabilitu při skladování při nízké vlhkosti a teplotách 4–5 °C nebo -20 °C. Pro siRNA byly výsledky ASAP v souladu s reálnými daty Stability study, kde po 15 měsících skladování při -20 °C nedošlo k významné ztrátě čistoty.

Přínosy a praktické využití metody

Akcelerovaná stabilitní studie výrazně zkracuje dobu nezbytnou pro stanovení trvanlivosti oproti klasickému testování v reálném čase (1–5 let). HILIC metoda s GTxResolve Premier BEH Amide kolónou poskytuje přímé a reprodukovatelné sledování degradantů oligonukleotidů bez nutnosti složité pasivace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace prediktivních modelů ASAP s digitalizovanými systémy QC a elektronickými lab_keep recordy
• Rozšíření akcelerované stability na nové formy nukleových kyselin, včetně modifikovaných mRNA a vektorových léčiv
• Použití pokročilých chromatografických materiálů a nanomateriálových adsorbentů pro zvýšení citlivosti analýzy
• Implementace ICH Q1A(R2) a dalších regulačních směrnic v prediktivních studiích stability

Závěr

ASAPprime® Modeling prokázalo flexibilitu a efektivitu při predikci dlouhodobé stability lyofilizovaných RNA standardů. Metoda podporuje optimalizaci balení i skladovacích podmínek a HILIC separace zajišťuje robustní sledování degradantů, což usnadňuje rozhodování v laboratořích vývoje i QC.

Reference

1. Waterman K.C., Swanson J.T., Lippold B.L. Scientific and Statistical Analysis of Accelerated Aging for Pharmaceuticals. Part 1: Accuracy of Fitting Methods. J Pharm Sci. 2014;103(10):3000–3006.
2. Li Y., Breaker R.R. Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2’-Hydroxyl Group. J Am Chem Soc. 1999;121:5364–5372.
3. Finny A.S., Johnston T., Sauner B., Addepalli B., Lauber M.A. Reproducible Hydrophilic Interaction Chromatography for Denaturing and Non-Denaturing Analyses of Oligonucleotides Using GTxResolve Premier BEH Amide Columns. Waters Application Note. 2024;720008456.