Characterizing Oligonucleotides

Význam tématu

Syntetické oligonukleotidy se v posledním desetiletí staly klíčovými léčivými látkami pro cílené zásahy proti dědičným a obtížně léčitelným onemocněním. Jejich komplexní struktura s modifikacemi a konjugacemi klade vysoké nároky na analytickou charakterizaci, aby byla zajištěna bezpečnost, účinnost a kvalita léčivých substancí.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem publikace je představit přehled chromatografických metod používaných pro potvrzení identity, sekvence, čistoty a strukturních modifikací syntetických oligonukleotidů. Text popisuje výhody a omezení jednotlivých režimů: ion-pairing RPLC, aniontovou výměnnou chromatografii (AEX), HILIC a velikostně vylučovací chromatografii (SEC).

Použitá metodika a instrumentace

Pro RPLC s iontovým párováním byly použity kolony ACQUITY Premier Oligonucleotide BEH C18 (130 Å a 300 Å) s různými aminy (triethylamin, hexylamin, diisopropylethylamin). Na platformě LC-MS byla aplikována technologie MaxPeak High Performance Surfaces pro lepší robustnost.
Aniontovou chromatografii prováděly kolony Gen-Pak FAX (nižší retence) a Protein-Pak HiRes Q (silnější retence) umožňující selektivní separace změnou pH a gradientu.
HILIC byla demonstrována na sloupci BEH Amide 130 Å, který využívá adsorpční H-vazby a vodní vrstvu pro ionticky párované i nepárované oligo.
SEC metody byly vyvíjeny pro nativní LC-UV-MS analýzu duplexních i jednovláknových oligonukleotidů s rozmezím 5–150 merů.

Hlavní výsledky a diskuse

Ion-pairing RPLC umožňuje přesné rozlišení až 30mer a díky širokým pórům i delších sekvencí. MaxPeak HPS zlepšuje reprodukovatelnost a citlivost. AEX nabízí nové selektivity od jemné regulace retence slabými výměnnými sloupcemi až po silné Q-sloupce, vhodné pro různé modifikace. HILIC jako alternativa bez iontového párování zkracuje dobu analýzy a zlepšuje kompatibilitu s MS. SEC zatím nebyla široce etablována, ale pro nativní stanovení duplexních struktur a rychlé odsolení ukazuje velký potenciál.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní potvrzení identity a purity léčivých oligonukleotidů
• Detekce n-1 krátkých terminovaných produktů a nežádoucích modifikací (oxidace, deaminace, depurinace)
• Flexibilita při vývoji metod pro různé délky a modifikace sekvencí
• Zvýšená robustnost a opakovatelnost díky optimalizovaným stacionárním fázím

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj ion-pairing-free metod HILIC s cílem zkrácení doby analýzy a lepší kompatibility s MS. Pokračovat budou inovace ve velikostně vylučovací chromatografii pro nativní studium duplexů a interakcí s proteiny. Vývoj stacionárních fází s vylepšenou povrchovou úpravou povede k vyšší citlivosti a delší životnosti kolon.

Závěr

Chromatografická charakterizace syntetických oligonukleotidů je zásadní pro vývoj a kontrolu kvality moderních léčiv. Kombinace IP-RPLC, AEX, HILIC a SEC poskytuje komplexní analytický přístup, zajišťuje potvrzení identity, čistoty i strukturních detailů a umožňuje adresovat nové výzvy při vývoji konjugovaných a modifikovaných oligonukleotidů.

Reference

1. Waters Application Note 720007362
2. Waters Application Note 720007395
3. Anal. Biochem. 659 (2022) 114956
4. Anal. Chem. 2023, 95, 38, 14308–14316