Quantifying Oligonucleotides (CONSUMABLES GUIDE BOOK)

Význam tématu

V posledním desetiletí se syntetické oligonukleotidové terapeutikum stávají klíčovým nástrojem při modulaci genové exprese a otevírají nové možnosti léčby genetických i získaných chorob. Spolehlivá kvantifikace těchto molekul v biologických matricích je nezbytná pro farmakokinetické studie, bezpečnostní hodnocení i klinický vývoj nových léků. LC-MS analýza oligonukleotidů nabízí vysokou citlivost, selektivitu a schopnost detekovat i nízké koncentrace ve složitých vzorcích.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem přehledu je představit ucelený workflow pro kvantitativní LC-MS stanovení oligonukleotidů od přípravy vzorku přes extrakci až po chromatografickou separaci a detekci. Autoři demonstrují optimalizované postupy pro narušení proteino-oligonukleotidových vazeb, spolehlivou SPE extrakci, zvýšení citlivosti pomocí modifikovaných kapilárních sloupků a automatizaci přípravy vzorků.

Použitá metodika

Proces analýzy zahrnuje následující kroky:

• Předúprava vzorku: detergenčně nezávislá proteolýza pomocí rekombinantního Proteinase K (RapiZyme™), denaturace guanidinem HCl a redukce TCEP pro efektivní uvolnění oligonukleotidů.
• Solid-phase extraction (SPE): využití OligoWorks™ SPE zařízení s WAX sorbentem z Oasis™ WAX pro zajištění vysokých a reprodukovatelných výtěžků (>90 % pro nezmodifikované ssDNA, >85 % pro lipidově konjugované ASO).
• Chromatografická separace: aplikace ultrakrátkých BEH C18 column s MaxPeak™ Premier HPS povrchem snižujícím nenaspecifické adsorpce a umožňujícím rychlé on-off eluce oligonukleotidů.

Použitá instrumentace

• LC-MS systém ACQUITY UPLC spojený s tandemovým spektrometrem Xevo TQ-XS.
• ACQUITY Premier Oligonucleotide BEH C18 columns (20–150 mm) a VanGuard FIT ochranné kazety.
• MaxPeak Premier High-Performance Surface technologie pro zvýšení signálu a opakovatelnosti.
• Automatický pipetovací robot Andrew+™ s OneLab™ softwarem pro standardizovanou přípravu vzorků.

Hlavní výsledky a diskuse

Nasazením Proteinase K místo detergentů se výrazně zlepšila účinnost extrakce a snížila variabilita způsobená surfaktanty. OligoWorks SPE prokázalo konzistentní výtěžky nad 80 % v různých biovzorcích. MaxPeak Premier povrch zvýšil MS intenzitu až 12násobně a zlepšil opakovatelnost až desetkrát. Ultrakrátké chromatografické sloupce dovolují separaci během 1 minuty díky striktnímu on-off retention mechanismu. Integrovaná VanGuard FIT kazeta výrazně prodlužuje životnost analytických sloupků.

Přínosy a praktické využití metody

Měřicí postup nabízí:

• Vysokou citlivost a selektivitu pro kvantifikaci trace-level koncentrací oligonukleotidů.
• Reprodukovatelnost napříč šaržemi a materiály díky standardizované SPE sorbentové technologii.
• Rychlé analýzy a vysokou propustnost laboratoře s možností plné automatizace přípravy vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj nanoscale kapilárních sloupků, nové sorbentové povrchy pro minimalizaci adsorpce a plná integrace do robotizovaných platforem. Další aplikace mohou směřovat k analýze mRNA, modifikovaných nukleotidů a komplexních biologických struktur, stejně jako k nasazení v klinických laboratořích pro terapeutický monitoring.

Závěr

Popsaný workflow kombinuje detergent-free enzymatickou digesci, spolehlivou WAX SPE extrakci a pokročilou chromatografickou technologii, což vede k robustnímu, vysoce citlivému a vysoce škálovatelnému LC-MS kvantitativnímu stanovení oligonukleotidů v biologických matricích.

Reference

• Araya et al., Elements of robust SPE-based oligonucleotide extraction.
• Brennan et al., Improved Oligonucleotide SPE-LC-MS Analysis Using MaxPeak High Performance Technology (App Note 720007019EN).
• Lardeux et al., High-Throughput Chromatographic Separation of Oligonucleotides: A Proof of Concept Using Ultra-Short Columns, Analytical Chemistry 2023, 95(27), 10448–10456.