Simultaneous quantitation and discovery (SQUAD): an intelligent combination of targeted and untargeted metabolomics workflow for the analysis of fecal metabolites using Orbitrap Astral MS

Význam tématu

Střevní mikrobiom generuje širokou škálu malých molekul, které odrážejí zdraví hostitele a metabolické procesy. Fekální metabolomika proto nabývá na významu jak v základním výzkumu, tak v klinické diagnostice. SQUAD přináší inovativní přístup, který spojuje cílenou kvantifikaci s objevováním neznámých metabolitů, čímž rozšiřuje možnosti analýzy komplexních biologických vzorků.

Cíle a přehled studie

Jednotlivé cíle studie:

• Vývoj workflow SQUAD pro simultánní cílenou kvantifikaci a neřízenou analýzu (discovery) fekálních metabolitů.
• Testování metody na vzorcích stolice myší s různými dietami (sójový olej, kakaové máslo, olivový olej).
• Porovnání metabolických profilů pomocí principové komponentní analýzy a anotace neznámých sloučenin.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika extrakce a analytické separace:

• Extrahování vzorků 80% metanolem, sušení a rekonstituce v 50% acetonitrilu.
• Chromatografie na kolonu Thermo Scientific Accucore 150 Amide HILIC pomocí Vanquish Horizon UHPLC.
• Ionizace pomocí pozitivní i negativní ESI.

Mass spectrometrie a software:

• Orbitrap Astral MS pro paralelní full scan (Orbitrap) a citlivé MS2 skeny (Astral).
• Analýza dat v TraceFinder 5.1 a Compound Discoverer 3.4 s podporou knihovny mzCloud.

Hlavní výsledky a diskuse

• Kalibrační křivky pokrývají široký dynamický rozsah (4 řády) s LLOQ 2,85 fmol a LLOD 0,71 fmol na kolonu.
• Cílená kvantifikace žlučových kyselin ukázala výrazné rozdíly mezi dietními skupinami.
• Untargeted analýza přinesla vysoký počet kvalitních MS2 dat, což umožnilo důkladnou anotaci a objev neznámých metabolitů.
• PCA a heatmapy potvrdily koloraci metabolických profilů podle typu stravy.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní workflow umožňuje současnou kvantifikaci známých sloučenin a objevování nových molekul.
• Zvýšená citlivost a rychlost analýzy díky paralelní akvizici Orbitrapu a Astralu.
• Uplatnění v preklinickém výzkumu, farmakometabolomice a QA/QC laboratorních procesů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metodiky na lidské vzorky a další biologické matrice. Integrace výsledků metabolomiky s dalšími „omics“ disciplínami a využití pokročilých algoritmů umělé inteligence pro zefektivnění anotace a interpretace neznámých sloučenin posune oblast dále k personalizované medicíně.

Závěr

Studie představuje robustní a unikátní SQUAD přístup, který efektivně kombinuje cílenou kvantifikaci a untargeted analýzu fekálních metabolitů. Využití Orbitrap Astral MS poskytuje vysokou kvalitu dat pro hluboké zkoumání metabolomů a otevírá nové možnosti v biomedicínském výzkumu.