Development and implementation of a comprehensive fecal metabolites LC-MS library for dietary intervention studies using the Thermo Scientific Stellar mass spectrometer

Význam tématu

Analýza střevních metabolitů hraje klíčovou roli při porozumění interakcím mezi stravou, střevní mikroflórou a zdravím organismu. Vysokokapacitní a vysoce citlivé kvantitativní metody LC-MS umožňují sledovat změny metabolitů při různých stravovacích intervencích, urychlují identifikaci biomarkerů a posilují translaci poznatků z preklinického výzkumu do klinické praxe.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl demonstrovat možnosti nového hmotového spektrometru Stellar při tvorbě rozsáhlé LC-MS knihovny střevních metabolitů a její implementaci pro kvantitativní analýzu ve vysoké propustnosti. Konkrétně autoři:

• Představili rychlý a intuitivní vývoj metod pomocí rychlého skenování a selektivity přístroje Stellar
• Ověřili analytický výkon (citlivost, přesnost, selektivita) při analýze vzorků moči myší s odlišnými dietami
• Prokázali schopnost vysokopropustné analýzy bez kompromisů na kvalitě dat
• Validovali detekci různých tříd sloučenin včetně koelujících izomerů pomocí MSn fragmentace

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: Stolice myší po 29denních dietních intervencích (standardní, nasycené a mononenasycené tuky). Extrakce 80 % methanolem. Kalibrace na 0 až 20 mikromolárních ředěních.

Chromatografie:

• UHPLC systém Vanquish Horizon (Thermo Scientific)
• Tři LC kolony: Hypersil GOLD C18 reversed-phase, Accucore Amide HILIC, Acclaim Trinity P2 mixed-mode
• Dlouhé gradienty (15–24 min) a krátké (5–12 min) pro test propustnosti
• Různá mobilní fáze s formiátem/amoniakálními pufry a kyselinou formiovou či octovou

Hmotová spektrometrie:

• Stellar hmotový spektrometr (Thermo Scientific) s kombinací triple kvadrupólu a dvojitě tlakového lineárního iontového pasti
• Režimy: MS1 full-scan s polaritou switching, tMS2 a tMS3 střídavě HCD/CID fragmentace
• Rychlost skenování: až 140 Hz pro MS2, 40 Hz pro MS3

Hlavní výsledky a diskuse

Zavedené metody dosáhly velmi nízké meze kvantifikace (femtomolární hladiny) a lineárního rozsahu až 5 řádů. Analýzy ukázaly:

• Vysokou opakovatelnost retence i intenzity signálu u interních standardů (< 5 % CV)
• Nárůst deoxycholové a muricholové kyseliny ve stolici myší na dietě s nasycenými tuky
• Možnost selektivní kvantifikace koelujících izomerů (např. fenyloctová vs. 4-hydroxypentová kyselina) díky diagnostickým fragmentům v MS2
• Schopnost běhu velmi krátkých gradientů bez ztráty citlivosti

Přínosy a praktické využití metody

Díky vysoké citlivosti a selektivitě umožňuje Stellar MS rychlou a robustní kvantifikaci stovek metabolitů v jednom běhu bez nutnosti opakovaných injekcí. To usnadňuje biomarkerové studie, sledování metabolických změn i rutinní QA/QC v průmyslové a klinické praxi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Implementace MSn technik v kombinaci s adaptivním řízením retence otevře cestu pro:

• Rozšíření cílených workflows pro jiné biolátky a matricové typy
• Integraci s umělou inteligencí pro prediktivní optimalizaci metod
• Miniaturizaci a multiplexní formáty pro ještě vyšší propustnost
• Bezproblémové přechody od objevné metabolomiky k validaci biomarkerů

Závěr

Stellar hmotový spektrometr významně posouvá možnosti kvantitativní metabolomiky díky kombinaci rychlosti, citlivosti a selektivity. Vytvořená střevní LC-MS knihovna a popsané pracovní postupy umožňují efektivní vysokopropustné studie dietních vlivů a podporují translaci objevů do klinických a průmyslových aplikací.

Reference

1. MetaSci, Inc. Fecal Metabolites Library, part number msifec0001