Simultaneous quantitation and discovery (SQUAD) metabolomics workflow on the orbitrap IQ-X for the analysis of fecal bile acids

Význam tématu

Žlučové kyseliny zajišťují emulgaci tuků, ovlivňují metabolické a imunitní procesy a jejich střevní metabolity odrážejí stav mikrobiomu i dietní vlivy. Přesná kvantifikace a současný objev nových konjugátů v trusu je klíčový pro klinické biomarkery, výzkum interakcí mikrobiomu a hodnocení výživových intervencí.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a implementovat SQUAD workflow (Simultaneous Quantitation And Discovery) pro simultánní kvantitativní a objevnou analýzu primárních a sekundárních žlučových kyselin a jejich konjugátů ve vzorcích trusu myší pod různými dietami. Studie kombinuje přesnou kvantifikaci vybraných metabolitů s neomezeným vyhledáváním dosud neznámých sloučenin.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnovala extrakci vzorků 80 % methanolem, vysušení a rekonstituci v 50 % methanolu s izotopově značenými interními standardy. Separace proběhla na Thermo Scientific Vanquish Horizon LC s Hypersil GOLD C18 kolonkou. Detekce a fragmentace byly provedeny na Orbitrap IQ-X Tribrid MS. Workflow doplnily funkce AcquireX pro tvorbu dynamického seznamu prekurzorů a Real-Time Library Search (RTLS) pro selektivní spouštění MS3 fragmentací. Datové zpracování zajistily softwary TraceFinder 5.1 a Compound Discoverer 3.4.

Hlavní výsledky a diskuse

Kalibrační křivky s neznačenými i izotopově značenými standardy umožnily absolutní kvantifikaci v rozsahu pěti řádů, s LLOQ 5 pg na kolonu a variabilitou měření (CV) pod 10 %. Cílové stanovení odhalilo významné rozdíly hladin žlučových kyselin mezi dietními skupinami myší. Necílená analýza pomocí PCA a heat map potvrdila odlišné metabolomické profily jednotlivých skupin. RTLS zajišťovalo selektivní MS3 fragmentaci u neznámých analogů, což usnadnilo jejich strukturální elucidaci.

Přínosy a praktické využití metody

• Simultánní cílená kvantifikace a neomezený objev metabolitů v jediném běhu
• Vysoká citlivost a spolehlivost díky izotopovým interním standardům a robustní kalibraci
• Možnost aplikace v mikrobiomových studiích, klinické diagnostice a výživových intervencích

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s multi-omickými přístupy a strojovým učením pro automatizované anotace
• High-throughput screening pro rozsáhlé kohortové studie
• Rozšíření workflow na další skupiny biochemicky významných metabolitů

Závěr

Vyvinuté SQUAD workflow nabízí robustní a všestranný nástroj pro současnou kvantifikaci a objev metabolitů spojených se žlučovými kyselinami. Kombinace LC separace, vysoké hmotnostní přesnosti Orbitrap MS a pokročilých softwarových nástrojů umožňuje podrobné zkoumání metabolických změn vlivem diet a mikrobiomu.

Reference

Stewart A. et al. Simultaneous quantitation and discovery (SQUAD) metabolomics workflow on the Orbitrap IQ-X for the analysis of fecal bile acids. Thermo Fisher Scientific; 2024.