Optimized enrichment and analysis of MHC-I peptides for comprehensive immunopeptidome profiling

Význam tématu

Identifikace a kvantifikace MHC-I vázaných peptidů umožňuje detailní mapování imunitního repertoáru a je zásadní pro vývoj imunoterapií a personalizovaných vakcín. Robustní a reprodukovatelná metoda pro obohacení immunopeptidomu zvyšuje důvěryhodnost získaných dat a podporuje výzkum přesné medicíny.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout zjednodušený, plně automatizovatelný pracovní postup pro izolaci a analýzu MHC-I asociovaných peptidů se zaměřením na:

• reprodukovatelnost obohacení peptidů
• kompatibilitu s magnetickými nosiči a automatizačními platformami
• maximální pokrytí immunopeptidomu v krátkém čase
• přesnou kvantifikaci pomocí interního standardu

Použitá metodika

Buňky HCT116 s a bez IFN-γ stimulace byly lyzovány za použití čtyř komerčních pufrů. Pro imunoizolaci se použila protokol přímého spárování W6/32 protilátky s nosiči:

• Pierce Protein A/G Magnetic Agarose
• CNBr-aktivovaný Sepharose

Eluce peptidů v kyselém prostředí byla následována přidáním kalibrační směsi PRTC. Čištění probíhalo v C18 a SDB spin tipech, případně pomocí 10 kDa MWCO filtru. Finální vzorky byly analyzovány nanoLC-MS/MS.

Použitá instrumentace

Pro separaci a detekci byly využity:

• Thermo Scientific Vanquish Neo UPLC
• IonOpticks Aurora Ultimate XT 25 cm × 75 µm C18 kolona
• Orbitrap Exploris 480
• Orbitrap Astral MS
• Thermo Scientific Eclipse Tribrid MS
• KingFisher automatizační platforma
• Skyline a PEAKS Studio 12.5 pro analýzu dat

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky ukázaly, že:

• Mem-PER plus lyzační buffer poskytl nejvyšší počet peptidových identifikací s CV < 10 %
• Pierce Protein A/G Magnetic Agarose dosáhla o 15 % více ID než CNBr Sepharose
• C18 spin tipy zvýšily identifikace o 5–8 % ve srovnání se SDB
• Orbitrap Astral MS zlepšil citlivost pro nízkomolekulární peptidy oproti Exploris 480
• Pracovní postup umožnil identifikaci > 6000 peptidů během ~7 hodin

Přínosy a praktické využití metody

Navržený postup nabízí:

• vysokou obnovu peptidů a denní reprodukovatelnost
• možnost automatizace na KingFisher pro vyšší průchodnost
• interní standard PRTC pro kontrolu kvality a kvantitativní analýzu
• kompatibilitu s nejmodernějšími MS platformami

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávaný vývoj zahrnuje:

• integraci real-time monitoringu při přípravě vzorků
• rozšíření workflow o MHC-II peptidy a jiné imunorelevantní komplexy
• aplikaci umělé inteligence pro de novo sekvenování a interpretaci dat
• miniaturizaci a single-cell immunopeptidomics

Závěr

Optimalizovaný protokol s magnetickými nosiči, C18 čistícím krokem a PRTC standardem poskytuje rychlou, robustní a reprodukovatelnou cestu k detailnímu profilování MHC-I peptidů v průměru do jednoho pracovního dne.

Reference

1. Hesnard L., Thériault C., Cahuzac M., Durette C., Vincent K., Hardy M.-P., Lanoix J., Lavallée G.O., Humeau J., Thibault P., Perreault C. Immunogenicity of Non-Mutated Ovarian Cancer-Specific Antigens. Current Oncology 31(6):3099–3121, 2024.