Translating peptide evidence into immunotherapy targets: Orbitrap Tribrid Apex MultiOmics MS delivers high-confidence spectral annotation

Význam tématu

Imunopeptidomika mapuje peptidy prezentované molekulami HLA, které určují, které epitopy rozpoznají T-lymfocyty. Přesná identifikace sekvence a modifikací peptidů je kritická pro vývoj neoantigenových vakcín, návrh adopčních T-buněčných terapií a pro odstraňování rizik u kandidátních cílů. Nízká hojnost peptidů, izobarické zbytky, posttranslační modifikace nebo nekanonické sekvence vedou ke zhoršení jistoty při přiřazení spektra, což může mít zásadní dopad na biologické a klinické závěry.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ověřit, zda použití EThcD fragmentace na Orbitrap Tribrid Apex MultiOmics MS zlepší pokrytí sekvence HLA třídy I peptidů a tím zvýší jistotu při anotaci neoantigenů. Autoři také vyvinuli hybridní workflow Neo-SCOAD (Neoantigen Simultaneous Confirmation and Discovery), který kombinuje discovery DDA analýzu s cílenými PRM skeny v jedné injekci, aby bylo možné současně potvrdit předem vybrané cíle a rozšířit záběr objevování.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: buňky HCT116 kultivované s a bez IFN-γ (10 ng/mL) a odebrané po přes noc inkubaci. Imunoprecipitace MHC I proběhla pomocí sady Pierce MHC Class I Antibody Coupling Kit a W6/32 protilátky v kombinaci s Protein A/G magnetickými agarózovými částicemi; použit byl KingFisher Apex pro automatizaci čištění. Extrakce proběhla z 10 milionů buněk; množství nanesené na kolonu odpovídalo ekvivalentu jednoho milionu buněk. Peptidy byly eluovány 1 % TFA, vysušeny a resuspendovány v 0,1 % kyselině mravenčí.

Chromatografie a MS: separace proběhla na Vanquish Neo UHPLC systému s IonOpticks Aurora Ultimate 25×75 XT C18 kolonií (run 72 min), zdroj EASY-Spray. Analýzy prováděny na Thermo Scientific Orbitrap Tribrid Apex MultiOmics MS. Srovnávaly se dvě fragmentační strategie: vysokorychlostní kolizně indukované HCD a kombinované elektronové přenosové s dodatečným kolizním uštěpením EThcD. Pro kombinované workflow Neo-SCOAD autoři integrovali DDA a PRM (cílené tMS2) v jedné metodě se 26 cílovými HLA peptidy.

Výpočetní analýza: data zpracována v PEAKS Studio 13 s DeepNovo peptidomickým workflow; vyhledávání proti UniProt human databázi bez omezení enzymu. Analýza motifů a predikce vazby pro 9mer peptidy prováděna pomocí Seq2Logo a NetMHCpan 4.1. Cílené PRM skeny analyzovány v Skyline.

Hlavní výsledky a diskuse

EThcD oproti HCD:

• EThcD generuje větší počet fragmentačních iontů pokrývajících více míst rozštěpení peptidového skeletu, včetně doplňujících iontových sérií (c/z vedle b/y), což zvyšuje informaci pro určování pořadí aminokyselin.
• Podíl peptidů s velmi vysokým pokrytím sekvence (definovaným jako >80 % confident amino acids - CAA) se při použití EThcD zhruba zdvojnásobil ve srovnání s HCD, což vede k vyšší jistotě při přiřazení sekvencí a identifikaci variant či posttranslačních modifikací.
• Celkový počet identifikovaných peptidů ukázal komplementární chování: každá fragmentační strategie přispívá unikátními identifikacemi a dohromady rozšiřují celkový identifikovaný repertoár.

Neo-SCOAD workflow:

• Implementace EThcD do hybridního DDA–PRM režimu umožnila souběžnou konfirmační analýzu 26 předem vybraných HLA peptidů a zároveň zachování discovery komponenty. To poskytuje vyšší konfidenčnost u prioritních neoantigenů, přičemž rozšíření imunopeptidomu je stále možné.
• Praktický kompromis: Neo-SCOAD vykazoval nižší celkovou rychlost objevování peptidů v discovery části než standardní DDA; toto snížení je způsobeno sdílením časového cyklu instrumentu mezi cílenými a ne-cílenými MS2 událostmi.

Další pozorování:

• Nezaznamenaly se systematické rozdíly v přiřazení alel nebo preferovaných vazebných motivů mezi HCD a EThcD datasetem, což naznačuje, že EThcD nezkresluje biologické interpretace týkající se HLA preference.

Přínosy a praktické využití metody

Výsledky ukazují, že použití EThcD na Orbitrap Tribrid Apex MultiOmics MS podstatně zvyšuje přesnost sekvenčních anotací v imunopeptidomice, což má přímý dopad na:

• výběr a validaci neoantigenů pro vakcíny nebo T-buněčné terapie;
• odhalování nekanonických sekvenciálních variant a lokalizaci PTM;
• redukci falešně pozitivních anotací v klinicky orientovaných studiích;
• kombinovanou strategii Neo-SCOAD, která nabízí praktický způsob, jak spojit potvrzení prioritních cílů a discovery bez nutnosti dvou separátních běhů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Neo-SCOAD a přidružené strategie integrující EThcD naznačují několik směrů rozvoje:

• dynamická optimalizace cyklu mezi cílenými a discovery skeny pro minimalizaci ztrát v discovery rychlosti;
• pokročilé algoritmy pro fúzi výsledků z různých fragmentací (HCD + EThcD) v reálném čase k zajištění maximálního pokrytí a konfidence;
• aplikace na vzorky s extrémně nízkou hojností antigenů (biopsie, biofluidy) díky lepšímu využití cenných spekter;
• integrování s pokročilými de novo nástroji a hlubokým učením pro lepší detekci nekanonických peptidů a neoantigenů;
• standardizace workflow pro klinické laboratorní aplikace a validace k zajištění reprodukovatelnosti napříč centry.

Závěr

Testování EThcD na Orbitrap Tribrid Apex MultiOmics MS pro imunopeptidomiku ukázalo výrazné zlepšení pokrytí sekvence a tím i vyšší jistotu při identifikaci HLA třídy I peptidů v porovnání s konvenční HCD fragmentací. Hybridní Neo-SCOAD metoda nabízí praktickou cestu ke kombinaci cílené konfirmační analýzy a discovery v jedné injekci, i když za cenu snížení discovery throughputu kvůli rozdělení instrumentálního času. Celkově poskytuje přístup lepší základ pro výběr a validaci imunoterapeutických cílů.

Reference

1. Thomsen MCF, Nielsen M. Nucleic Acids Research 2012; 40 (W1): W281-W287.
2. Reynisson et al. Nucleic Acids Research 2020; 48(W1): W449-W454.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Tribrid Apex MultiOmics MS (Thermo Scientific)
• Vanquish Neo UHPLC system (Thermo Scientific)
• IonOpticks Aurora Ultimate 25×75 XT C18 UHPLC Column
• Thermo Scientific EASY-Spray Ion Source
• KingFisher Apex Purification System
• Pierce MHC Class I Antibody Coupling Kit a W6/32 protilátka
• Protein A/G Magnetic Agarose Beads
• PEAKS Studio 13 s DeepNovo workflow
• Seq2Logo, NetMHCpan 4.1 pro motif a vazebné predikce
• Skyline pro analýzu PRM dat