A Novel Proteomics Magnetic Clean-up Bead for Automated Mass Spectrometry Sample Preparation

Význam tématu

Proteomika založená na hmotnostní spektrometrii vyžaduje důkladné odstranění detergentů, solí a dalších kontaminantů před analýzou. Rychlé a automatizované postupy šetří čas i náklady, minimalizují variabilitu vzorků a zvyšují reprodukovatelnost výsledků. Vývoj nových magnetických kuliček pro čistění proteomických vzorků umožňuje integrovat přípravu vzorků do robotizovaných platforem a zkrátit dobu přípravy z desítek hodin na několik hodin.

Cíle a přehled studie / článku

Autoři představují nový typ Thermo Scientific Proteomics Magnetic Clean-up Beads a hodnotí jejich výkonnost ve srovnání s tradičními metodami. Studie si kladla za cíl:

• Ověřit efektivitu remoce detergentů a kompatibilitu s různými lyzačními pufry.
• Porovnat manuální a automatizované zpracování vzorků (KingFisher Apex).
• Demonstraci metody na standardní BSA, kultivovaných buňkách HEK293, ledvinových tkáních myši a lidském plicním tkáňovém materiálu (normální vs. nádorové vzorky).

Použitá metodika a instrumentace

Protokol magnetického čištění zahrnuje:

• Redukci a alkylaci proteinů (95 °C, 15 min).
• Vázání na magnetické kuličky v roztoku 99,5 % IPA/0,5 % TFA (45 min, pokojová teplota).
• Dwoukolovým praním (100 % acetonitril, poté 70 % ethanol/water).
• Trávicí kroky s trypsinem/Lys-C při 37 °C (3 h).
• Konečné eluční strevní v 0,5 % kyselině mravenčí.

Automatizace probíhala na přístroji KingFisher Apex. Separace se prováděla na UPLC systémech Vanquish Neo a IonOpticks Aurora Frontier TS. Detekce mase byly provedeny na Orbitrap Exploris 480 a Orbitrap Astral s FAIMS Pro Duo Interface. Data zpracována softwary Spectronaut, DIA-NN a Proteome Discoverer s algoritmem CHIMERYS.

Hlavní výsledky a diskuse

Testy s BSA ukázaly:

• Více než 85 % sekvenční pokrytí.
• Více než 100 unikátních peptidů a 0 % chybějících štěpných míst.

Porovnání metod na HEK293 a membránových přípravcích ukázalo obdobný počet identifikací proteinových skupin a unikátních peptidů s CV přibližně 8 %. U plicních tkání došlo k validaci bilirubinovaných biomarkerů (EGFR +1,9×, PD-L1 +2,8× v nádoru). Studie potvrdila konzistentní výsledky mezi manuálním a automatizovaným zpracováním i napříč různými lyzačními reagencemi.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Zkrácení doby přípravy vzorků z ~48 h na ~5 h.
• Vysokou kompatibilitu s různými lysis pufry (EasyPep, NE-PER, GPCR, Mem-PER Plus, T-PER, IP Lysis).
• Plnou automatizaci na platformách KingFisher, snížení lidské chyby.
• Široké uplatnění v QA/QC, biomedicínském výzkumu i rutinní laboratorní analýze.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Dálší zrychlení protokolů pro single-cell proteomiku a ultra­nízkou vstupní hmotnost.
• Integrace s online destilačními tržišti a mikrofluidickými systémy.
• Vylepšení algoritmů pro inteligentní zpracování dat v reálném čase.
• Rozšíření aplikací na posttranslační modifikace a interaktomiku.

Závěr

Proteomics Magnetic Clean-up Beads představují efektivní a univerzální nástroj pro přípravu vzorků pro MS proteomiku. Kombinují vysokou výtěžnost a reprodukovatelnost s možností plné automatizace, což výrazně usnadňuje průběžné i velkoplošné proteomické studie.

Reference

1. Mitsudomi, T., & Yatabe, Y. (2010). Epidermal growth factor receptor in relation to tumor development: EGFR gene and cancer. The FEBS Journal, 277(2), 301–308.
2. Garon, E. B., Rizvi, N. A., Hui, R., et al. (2015). Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine, 372(21), 2018–2028.