Investigation of Oligonucleotide Deamination Using High Resolution Mass Spectrometry

Význam tématu

Oligonukleotidová deaminace představuje klíčový degradační proces cytosinu a 5‐metylcytosinu vedoucí k transformaci na uracil a thymin. Tento jev ovlivňuje stabilitu a účinnost terapeutických oligonukleotidů, a proto jeho kvantifikace a kontrola hrají zásadní roli ve vývoji bioléčiv a analytických QC protokolů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit použití vysoce rozlišovací hmotnostní spektrometrie (HRMS) pro detekci a kvantifikaci deaminovaných oligonukleotidů. Autoři navrhli výpočet Isotopického Distribučního Faktoru (IDF) založeného na posunu intenzit izotopových peaků, který umožňuje stanovit relativní obsah čistého full-length produktu (FLP) a deaminovaného impuritu.

Použitá metodika a instrumentace

Všechna měření probíhala na systému Waters ACQUITY Premier UPLC BSM spojeném s Xevo G3 QTof hmotnostním spektrometrem v negativním iontovém módu. Klíčové parametry:

• Kolona: ACQUITY Premier OST 2.1×50 mm
• Mobilní fáze: ion‐pair reverzní fáze s 5 mM TBuAA, 1 μM EDTA ve vodné i acetonitrilové složce
• Gradient: 60–80 % organické fáze za 1,45 min, celková doba běhu 3,7 min
• MS podmínky: m/z 400–4000, desolvační teplota 450 °C, zdrojová 120 °C, kapilární napětí 2 kV

Vzorky byly připraveny přidáním známého množství syntetického deaminovaného ASO impuritu do čistého FLP v rozmezí 0.10–5.00 %.

Hlavní výsledky a diskuse

Vysoké rozlišení QTof umožnilo opakovaně zaznamenat izotopové distribuce FLP a impuritu s posunem +0.9848 Da. Výpočet IDF na základě součtu intenzit izotopových peaků P1–P4 (vlevo od hlavního izotopu P5) a P6–P12 (vpravo od P5) prokázal:

• Lineární vztah naměřených IDF vůči procentuálnímu zastoupení deaminovaného impuritu (R2 blízké 1).
• Vysokou opakovatelnost měření u tří injekčních replikátů a nezaspikeovaných kontrol.
• Schopnost rozlišit nízké úrovně deaminace od 0.10 % v rozumném časovém rámci (~150 min pro šest vzorků plus kontroly).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda založená na IDF a HRMS nabízí přesné a citlivé stanovení deaminace, což je pro QC laboratoře v farmaceutickém průmyslu zásadní. Mezi hlavní přínosy patří:

• Rychlá analýza s minimálním časem na kolonu a měření.
• Široké lineární rozmezí pro kvantifikaci nízkých i vyšších úrovní degradace.
• Možnost implementace do standardních QC postupů pro bioléčiva.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj metody může zahrnovat integraci pokročilých softwarových nástrojů pro automatizovaný výpočet IDF přímo ve výrobním prostředí. Výhledově lze tuto strategii aplikovat i na další typy chemických modifikací oligonukleotidů či komplexnější směsi degradačních produktů.

Závěr

Studie demonstrovala, že systém Xevo G3 QTof v kombinaci s UPLC a výpočtem IDF poskytuje robustní, přesné a opakovatelné měření deaminace oligonukleotidů. Metoda je vhodná pro aplikace ve vývoji a kontrole kvality terapeutických oligonukleotidů.

Reference

• Rentel C, DaCosta J, Roussis S, Chan J, Capaldi DC, Mai B Pharm Biomed Anal 2019 173 56–61
• Capaldi DC Stress testing of oligonucleotides In Baertski SW Alsante KM Reed RA Pharmaceutical Stress Testing 2nd ed Informa Healthcare 2011 391–425
• ICH Q1A(R2) Stability Testing of New Drug Substances and Products 2003