Assessing the Purity of an Antisense Oligonucleotide Sample by LC/MS

Význam tématu

Antisense oligonukleotidy (ASO) představují významnou třídu terapeutických molekul používaných pro modulaci genové exprese. Jejich složitá struktura a vysoká molekulová hmotnost vyžadují spolehlivou kontrolu kvality, zejména kvantifikaci nečistot a stanovení čistoty. LC/MS je klíčovou technikou pro tyto účely, přičemž jednotkově hmotnostní detektor nabízí praktické a rutinní řešení pro testovací laboratoře.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit možnost použití LC/MS systému Agilent InfinityLab Pro iQ Plus s jednotkovou hmotnostní detekcí pro rychlé stanovení čistoty ASO vzorku. Pomocí softwaru Oligo Analysis Accelerator (OAA) se usnadnila integrace špiček a interpretace spekter, což zefektivnilo QC workflow zaměřené na základní rysy purity a profil nízkoúrovňových nečistot.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek tvořil 20-merní ASO rozpuštěné na 0,1 mg/mL. Analytická sestava zahrnovala:

• LC: Agilent 1290 Infinity II bio systém (binary pump, multisampler, column compartment) s AdvanceBio Oligonucleotide kolonkou (2,1×150 mm, 2,7 µm).
• Detekce UV: 260/4 nm, teplota vzorku 8 °C.
• MS: Agilent InfinityLab Pro iQ Plus (G6170A) se skenováním m/z 1 450–2 175, ESI v negativním módu, dvě nastavení (standard a harsh) pro identifikaci aduktů.
• Mobilní fáze: A – 10 % ACN s 5 mM tributylammonium acetátem, 1 µM EDTA; B – 80 % ACN se stejnými doplňky; gradient 45–80 % B.
• Software: OpenLab CDS pro sběr dat a Oligo Analysis Accelerator pro analýzu spekter a EIC integraci.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vysokou citlivost (LOQ ≥ 0,2 %) a stabilní přenos iontů v rozsahu až do m/z 3 000. Monitorem stability přenosu byl kalibrantní iont m/z 2 234 po dobu 24 h. Porovnání spekter za standardních a harsh podmínek umožnilo rozlišit adukty. Pomocí OAA bylo identifikováno přes 20 iontů převyšujících definované prahové hodnoty, včetně hlavního produktu (m/z 1 826,3) a řady neznámých nečistot. Určené EIC špičky vedly k výpočtu MS čistoty 86,9 % oproti UV čistotě 98,0 %.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Rychlou a opakovatelnou QC analýzu ASO s jednotkovou hmotnostní detekcí.
• Možnost rutinního provozu v QC laboratořích bez potřeby high-resolution MS.
• Automatizovanou integraci a klasifikaci nečistot pomocí softwaru OAA.

Budoucí trendy a možnosti využití

V oblasti analýzy oligonukleotidů lze očekávat:

• Integraci vyšší automatizace a AI nástrojů pro pokročilou interpretaci spekter.
• Rozšíření metodiky na nové chemické modifikace a větší konstrukty nukleových kyselin.
• Využití vysokopropustných formátů pro screeningové aplikace.
• Možnost kombinace unit-mass a high-resolution MS pro komplexní charakterizaci.

Závěr

Použití Agilent InfinityLab Pro iQ Plus LC/MS se standardní detekcí prokázalo jako spolehlivá a účinná metoda pro stanovení čistoty antisense oligonukleotidů. Díky robustní iontové transmisní schopnosti a softwarové podpoře Oligo Analysis Accelerator může být tento přístup široce aplikován v QC laboratořích.

Reference

• Rentel C.; Gaus H.; Bradley K.; et al. Assay, Purity, and Impurity Profile of Phosphorothioate Oligonucleotide Therapeutics by Ion Pair–HPLC–MS. Nucleic Acid Ther. 2022, 32(3), 206–220.