Analysis of mRNA Cap Impurity Profiles and Capping Efficiency Using RapiZyme™ MC1 Ribonuclease

Význam tématu

V oblasti analytické chemie je přesná charakterizace mRNA 5’-cap klíčová pro hodnocení kvality a stability terapeutických mRNA přípravků. Cap struktura ovlivňuje translaci a imunitní odpověď, proto je sledování úrovně cappingu zásadní pro vývoj a kontrolu jakosti.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit použití RapiZyme MC1 ribonukleázy pro přímou analýzu profilu cap impurit a stanovení cappingové účinnosti v rámci standardního oligonukleotidového mapování mRNA. Autoři porovnali výsledky s konvenčními RNase T1 digesemi a vyhodnotili aplikaci IP-RP-LC-MS a waters_connect softwaru.

Použitá metodika

mRNA vzorky byly tráveny RNase T1 a RapiZyme MC1 za optimálních podmínek (60 °C, 1 hodina pro MC1). Následně byla použita iontově párová IP-RP-LC separace na ACQUITY Premier Oligonucleotide BEH C18 FIT kolonce s DPA/HFIP jako iontovým párem. Detekce proběhla pomocí vysokorozlišovacího ESI-QTof MS v režimu MSE.

Použitá instrumentace

• ACQUITY Premier System (Waters) s Xevo G3 QTof MS nebo Vion IMS QTof MS
• ACQUITY Premier Oligonucleotide BEH C18 FIT kolona, 2.1×150 mm, 1.7 μm
• Software waters_connect včetně aplikací INTACT Mass, CONFIRM Sequence a mRNA Cleaver

Hlavní výsledky a diskuse

RNase T1 digesce umožnila detekci pouze metylovaného cap fragmentu, neumožnila však odlišit necapped formu. Naproti tomu RNase MC1 generovala delší fragmenty zachovávající cap, což umožnilo identifikovat tři formy 5’-terminu: plně metylovaný cap1, nemetylovaný cap a necapped oligonukleotid. Proprietární mRNA vykázala ~70 % cap1, GFP mRNA ~96 % cap1 s nízkou mírou necapped forem.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednoetapní analýza cap profilu bez speciálních sond či RNase H
• Rychlá a reprodukovatelná kvantifikace cappingové účinnosti
• Integrace stanovení cap do běžného oligonukleotidového mapování

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit o vysokoprůchodnost pro screening více vzorků, kombinovat s NGS pro komplexní charakterizaci modifikací a implementovat do regulovaných QC postupů. Perspektivní je automatizace datové analýzy a aplikace na jiné šablony RNA.

Závěr

RapiZyme MC1 ve spojení s IP-RP-LC-MS a waters_connect představuje efektivní platformu pro charakterizaci 5’-cap struktur a stanovení cappingové účinnosti mRNA. Přístup zkracuje dobu analýzy a zvyšuje přesnost kontrolních postupů.

Reference

• Furuichi Y a Shatkin AJ Viral and cellular mRNA capping: past and prospects. Adv Virus Res 55:135–84 (2000).
• Gonatopoulos-Pournatzis T a Cowling VH Cap-binding complex (CBC). Biochem J 457:231–242 (2013).
• Webb ALJ et al. Characterization and analysis of mRNA critical quality attributes using liquid chromatography methods. J Chrom A 1745:465724 (2025).
• Chan SH et al. RNase H-based analysis of synthetic mRNA 5′ cap incorporation. RNA 28:1144–1155 (2022).
• Beverly M et al. Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS. Anal Bioanal Chem 408:5021–30 (2016).
• Doneanu CE et al. Oligo mapping of mRNA digests using a novel informatics workflow. Waters application note 720008677 (2025).
• Addepalli B et al. Tunable digestions of RNA using RapiZyme RNases to confirm sequence and map modifications. Waters application note 720008539 (2024).