Oligo Mapping of mRNA Digests Using a Novel Informatics Workflow

Význam tématu

Rozvoj mRNA vakcín a terapeutik vyžaduje spolehlivou a citlivou analýzu primární struktury a modifikací mRNA. LC-MS přístupy poskytují vysokou specifičnost, rozlišení i kvantifikaci, které jsou nezbytné pro potvrzení integrity sekvence, kontrolu 5’ cap struktury i heterogenitu Poly(A) svazu. Kombinace nových enzymů pro štěpení RNA a pokročilé informatiky výrazně zrychluje a zpřesňuje mapování oligonukleotidů.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje end-to-end workflow od přípravy vzorku přes UPLC™-QTof MS akvizici až po automatizovanou analýzu dat. Hlavním cílem je porovnání konvenční RNázy T1 s novými RNázami T2 (RapiZyme MC1 a Cusativin) a využití waters_connect MAP Sequence App pro automatické mapování štěpných produktů GFP mRNA. Kromě sekvenčního pokrytí je ukázána i aplikace na stanovení účinnosti 5’ capování.

Použitá metodika a instrumentace

Příprava vzorku zahrnovala in vitro transkripci GFP mRNA s Cap1 strukturou, následující denaturaci a enzymatickou štěpnou reakci s RNázami T1, MC1 a Cusativin za optimalizovaných podmínek (čas, teplota, pH). Štěpné produkty byly analyzovány UPLC™-BEH C18 kolonkou při 60 °C s ion-pair mobile fázi (DPA/HFIP) a detekovány na Xevo™ G3 QTof MS v režimu MSE.

Použitá instrumentace

• UPLC systém ACQUITY™ Premier (Binary)
• BEH™ C18 FIT kolona 2.1×150 mm, 1.7 µm
• Xevo™ G3 QTof MS s ESI(-) a MSE akvizicí
• software waters_connect UNIFI 3.6.0.21 a MAP Sequence App

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání enzymů ukázalo: RNáza T1 dosahovala unikátního sekvenčního pokrytí ~60 %, zatímco RapiZyme MC1 ~97 % a Cusativin ~85 %. Nové RNázy T2 generují delší úseky i kontrolované chybějící štěpy, čímž se snižuje počet izobarických produktů a roste důvěryhodnost přiřazení. Automatizované mapování pomocí MAP Sequence App umožnilo rychlou shodu předpovězených monoisotopických hmot s experimentálními daty a vizualizaci pokrytí ve Coverage Viewer. K vyřešení izomerických štěpných produktů byl úspěšně použit CONFIRM Sequence App na základě MSE fragmentačních dat. Pro stanovení účinnosti capování poskytly MC1 a Cusativin vysoce reprodukovatelné výsledky (79.8 % capovaných molekul), což u RNázy T1 nebylo možné kvůli příliš krátkým produktům.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow přináší výrazné zrychlení a automatizaci oligo mapování mRNA, zlepšuje přesnost potvrzení sekvence i modifikací a umožňuje kvantifikaci capových struktur v jediném běhu LC-MS. Uplatnění najde v biopharmaceutickém vývoji, kontrole kvality i validaci mRNA vakcín a terapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj softwaru pro integraci MSE fragmentačních dat rozšíří možnosti plné automatizace přiřazení. Rozšiřování enzymatického arzenálu a optimalizace podmínek štěpení podpoří analýzu stále delších a modifikovaných mRNA. Očekává se také propojení s vysoce výkonnou datovou analýzou a umělou inteligencí pro komplexní hodnocení kvality biologik.

Závěr

Popsaný přístup kombinuje inovativní RNázy T2 a pokročilou informatici pro rychlé a spolehlivé mapování mRNA štěpných produktů. Výsledná vysoká sekvenční krytí, schopnost rozlišení izomerů a kvantifikace capu potvrzují, že metoda představuje robustní nástroj pro charakterizaci mRNA vakcín a terapií.

Reference

• Xu S et al. mRNA Vaccine Era Mechanisms Drug Platform and Clinical Prospection Intl J Mol Sci 2020 21(18) 6582
• Verbeke R et al. The dawn of mRNA vaccines J Controlled Release 2021 333 511–520
• Jackson NA et al. The Promise of mRNA Vaccines npj Vaccines 2020 5 15
• Synthetic mRNA Oligo-Mapping Using Ion-Pairing LC MS Waters application note 2022 720007669
• RNA CQA Analysis using the BioAccord LC-MS System Waters application note 2023 720008130
• RNA Digestion Product Mapping Using an Integrated UPLC-MS Waters application note 2024 720008553
• Jiang T et al. Oligonucleotide Sequence Mapping via Parallel Ribonuclease Digestions Anal Chem 2019 91 8500–8506
• Vanhinsbergh CJ et al. Characterization and Sequence Mapping of Large RNA using Mass Spectrometry Anal Chem 2022 94 7339–7349
• Gau B et al. Oligonucleotide Mapping via MS to Characterize an mRNA Vaccine Sci Rep 2023 13 9038
• Tang S et al. High-Throughput Sequence Coverage Mapping of mRNAs Anal Chem 2024 96 16944–17003
• Tunable Digestion of RNA Using RapiZyme RNases Waters application note 2024 720008539
• CONFIRM Sequence App for Sequencing of Synthetic Oligonucleotide Waters application note 2022 720007677
• Rapid Analysis of a Synthetic mRNA Cap Structure BioAccord LC-MS System Waters application note 2021 720007329