Advanced Monoclonal Antibody Peptide Mapping Using Multi-Reflecting TOF MS Technology

Význam tématu

Peptidové mapování monoklonálních protilátek je klíčové pro charakterizaci jejich primární struktury, identifikaci bodových modifikací a sledování kontaminantů či nesprávně složených forem. Vysoce citlivá a přesná metoda umožňuje potvrdit sekvenci a kvalitu bioterapeutik ve fázi vývoje i ve výrobě a podporuje rozhodování v rámci procesního vývoje.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo demonstrovat výkonnost UPLC-Xevo MRT MS platformy pro hluboké peptidové mapování standardního tryptického digestu monoklonální protilátky (Waters mAb Tryptic Digestion Standard). Klíčové parametry zahrnovaly citlivost, dynamický rozsah, hmotnostní rozlišení a přesnost pod 1 ppm, včetně plně automatizovaného sběru a zpracování dat pomocí UNIFI App.

Použitá metodika

Příprava vzorku:

• Lyofilizovaný tryptický digest mAb standardu rekonstituován v ultrapure vodě (200 ng/µl), dále naředěn sérií ředění umožňující zátěže sloupce 2000 ng až 0,002 ng.

Chromatografie:

• Mobilní fáze A: voda s 0,1 % kyseliny formiové; B: acetonitril s 0,1 % kyseliny formiové.
• Gradientové eluce na kolonce C18 (1,7 µm, 2,1 × 100 mm) při 40 °C, průtok 0,25 ml/min.
• Injekce 0,2–10 µl, teplota vzorku 6 °C, detekce UV 280 nm pro kontrolu selektivity a reprodukovatelnosti.

Mass spectrometrie:

• Režim MSE s datově nezávislou fragmentací, rozsah 50–2000 m/z, polarita pozitivní.
• Snímací frekvence 2 Hz, napětí kónu 25 V, energie fragmentace 25–50 V.
• Teplota zdroje 120 °C, desorpční teplota 400 °C, plyn 800 l/h, kapilární napětí 3 kV.

Použitá instrumentace

• ACQUITY Premier UPLC System (Binary).
• Xevo MRT Multi-reflectron TOF Mass Spectrometer.
• Waters_connect UNIFI App pro automatizovaný sběr, zpracování a reporting dat.
• TruView LCMS certifikované injekční lahvičky se septem PTFE/Silicone.

Hlavní výsledky a diskuse

• Dosahnuto sekvenčního pokrytí 96 % pro lehký a 98 % pro těžký řetězec s hmotnostní chybou <1 ppm.
• Vysoké rozlišení až 100 000 FWHM, které je nezávislé na rychlosti skenování a m/z.
• Demonstrace detailní lokalizace oxidací (peptid DTLMISR) a glykozylací včetně variací Man5 a G0F s podrobností fragmentačních spekter.
• Reprodukovatelnost retence a intenzity ve 10 replikátech (RSD <2 %) a lineární kvantifikace přes pět řádů koncentrací (R²>0,999, RSD<10 %).

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost detailní charakterizace nižší hladin modifikací a čistot monoklonální protilátky.
• Široký dynamický rozsah umožňuje sledovat produktové varianty a degradační produkty současně.
• Automatizované a validovatelné workflow zrychluje rozhodovací procesy ve vývoji a kontrole kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

Peptidové mapování s datově nezávislou fragmentací MSE směřuje k širšímu uplatnění v online procesním monitoringu a rozšířeným studiím stability. Další integrace s cloudovými platformami a umělou inteligencí může zefektivnit interpretaci komplexních dat a podporovat rychlejší vývoj bioterapeutik.

Závěr

Implementace ACQUITY Premier UPLC a Xevo MRT TOF MS nabízí robustní, citlivou a vysoce přesnou platformu pro peptidové mapování monoklonálních protilátek. Díky automatizovanému zpracování v UNIFI App lze rychle získat spolehlivá data pro rozhodování ve vývoji, výrobě i kontrole kvality bioterapeutik.

Reference

1. EMA Guideline on development, production, characterisation and specification for monoclonal antibodies and related products. EMA/CHMP/BWP/532517/2008, 2016.
2. Nilini Ranbaduge et al. Routine Peptide Mapping Analysis using the BioAccord System. Waters Application Note 720006466, 2019.
3. K. DeLaney et al. Applying Peptide Mapping and Multi-Attribute Method Workflow for Biosimilar mAb Drug Products Comparison on the Xevo G3 QTof Platform. Waters Application Note 720007632, 2022.
4. V.B. Ivleva et al. Generating Automated and Efficient LC-MS Peptide Mapping Results with UNIFI. Waters Application Note 720004620, 2013.