Structural Elucidation of N-glycans Originating From Ovarian Cancer Cells Using High-Vacuum MALDI Mass Spectrometry

Význam tématu

Glykozylace je klíčová posttranslační modifikace ovlivňující strukturu a funkci proteinů a její změny v nádorových buňkách mohou sloužit jako biomarkery. Terminální fukosylace je spojena s progresí karcinomu a detailní charakterizace N-glykanů z nádorových buněk je důležitá pro diagnostiku a vývoj terapeutických strategií.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na izolaci a detailní strukturální určení fukosylovaných N-glykanů z lysátu ováriových karcinomových buněk. Hlavním cílem bylo identifikovat bi-antenární glykany s terminálními fukosylovanými LacNAc anténami a stanovit jejich izomerii (Lewis X, A, H1, H2).

Použitá metodika a instrumentace

• Redukce disulfidů a karboxymetylace glykoproteinů ve vzorku lysátu 10^6 buněk.
• Enzymatické uvolnění N-glykanů pomocí PNGase F a stabilizace permethylací.
• Čištění C18 reversed phase chromatografií a nanášení se matricemi DABP nebo DHB.
• MALDI-QIT-TOF-MS (Axima Resonance, Shimadzu) s vysokým vakuem (cca 10^-6 mbar) a CID fragmentací v ion trapu.
• Ruční interpretace spekter s podporou softwaru GlycoWorkbench a mMass.

Hlavní výsledky a diskuse

N-glykanový profil ukázal vysokou citlivost detekce i nízkohonotných glykanů. Ion 2592 m/z odpovídal fukosylovanému bi-antenárnímu glykanu s jádrovou fukosylací a dvěma mono-fukosylovanými anténami. MS2 analýza potvrdila přítomnost fragmentu 660 m/z jednoanténové struktury a ztrátu antén. MS3 spektrální fingerprint fragmentu 660 m/z porovnáním s referenčními standardy (Lewis X, A, H1) ukázal shodu s izomerem Lewis X na základě charakteristického iontu 329 m/z a poměru intenzit 472/454 m/z.

Přínosy a praktické využití metody

• Přímé pozorování glykanů bez nutnosti dodatečných enzymatických testů nebo lectinových analýz.
• Rychlé rozlišení izomerie fukosylovaných antén a tvorba spektrálních knihoven pro rychlou identifikaci.
• Možnost integrace do rutinního vyšetření glykomu v onkologické diagnostice.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření spektrálních databází glykanů pro vysokopropustné analýzy a automatizaci.
• Integrace výsledků do klinických studií a validace glyko-biomarkerů u pacientů s nádorem.
• Další vývoj nativního MALDI-QIT-TOF-MS pro rychlý screening komplexních glykanových profilů.

Závěr

High-vacuum MALDI-QIT-TOF MSn prokázal schopnost detailního strukturálního určení fukosylovaných N-glykanů z nádorových buněk a představuje efektivní nástroj pro objev glyko-biomarkerů v onkologii.

Reference

1. Ceroni A et al GlycoWorkbench A Tool for the Computer Assisted Annotation of Mass Spectra of Glycans Journal of Proteome Research 7 1650–1659 2008
2. Listinsky JJ Siegal GP Listinsky CM The emerging importance of α L fucose in human breast cancer a review American Journal of Translational Research 3 292–322 2011
3. Strohalm M et al mMass 3 A Cross Platform Software Environment for Precise Analysis of Mass Spectrometric Data Analytical Chemistry 82 4648–4651 2010