Structural characterization of mucin O-linked glycans using a novel anion exchange column in HPAE-PAD-MS

Význam tématu

Glykozylace představuje nejrozšířenější posttranslační modifikaci bílkovin, která ovlivňuje buněčnou adhezi, signalizaci a imunitní reakce. O-glykany v mucinech jsou navázány na serin a threonin a jejich změny bývají spojovány s nádorovými onemocněními. Detailní vyšetření O-glykanových profilů mucinů je proto zásadní pro pochopení biologické funkce a identifikaci potenciálních biomarkerů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo představit workflow pro analýzu O-glykanů uvolněných z mucinu typu III pomocí kombinace vysokovýkonné aniontové výměnné chromatografie s pulzní amperometrií (HPAE-PAD) sekvenčně napojené na Q Exactive Orbitrap MS. Klíčovým prvkem je nová Dionex CarboPac PA300-4µm kolona, jež umožňuje separaci neutrálních i nabitých glykanů bez derivatizace.

Použitá metodika a instrumentace

• Reduktivní β-eliminace pro uvolnění O-glykanů z mucinu a následná purifikace na HyperSep Hypercarb SPE.
• Chromatografie na Dionex CarboPac PA300-4µm (2×250 mm) s hydroxidickými a acetátovými eluenty.
• Detekce pulzní amperometrií (PAD) s pulzovaným programem na zlaté pracovní elektrodě a palladiové vodíkové referenční elektrodě (PdH).
• Elektrolyticky regenerovaný desalter ERD 500 pro odstranění vysoké koncentrace Na+ před vstupem do MS.
• MS analýza: Thermo Scientific™ Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap, negativní ESI, HCD MS/MS, data zpracována v Xcalibur.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila rozdělení a identifikaci 18 O-glykanů (neutrálních, sialylovaných, sulfovaných) s přesností <5 ppm. Neukázala se žádná nutnost derivatizace – glykanové alditoly byly detekovány jako deprotonované anionty. Neutralní glykanové izomery se oddělily v RT 4–32 min, sialylované ve 32–35 min a sulfované po 35 min. HCD MS/MS v negativním módu generovalo diagnostické fragmenty (A- a Y-štěpy) umožňující přiřadit jádrové struktury (core 1–4) a krevněskupinové epitopy. Extraktní chromatogramy ukázaly rozlišení izomerů (např. [Hex]₂Fuc[HexNAc]₃). Testy s ERD 500 vykázaly posun RT o ~0,4 min a mírné rozšíření píků (<50 % asymetrie), bez významného zhoršení rozlišení.

Přínosy a praktické využití metody

• Analyza bez derivatizace – zachovává původní strukturu glykanů.
• Kombinace vysoké citlivosti PAD a selektivity HRAM MS pro detailní profilování.
• PA300-4µm kolona nabízí vylepšenou separaci neutrálních glykanů oproti dřívějším platenám (PA200).

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze aplikovat na širší spektrum glykoproteinů v biotechnologii, potravinářství a klinické glykomice. Očekává se automatizace interpretace MS/MS dat s podporou databází (UniCarb-DB), rozšíření na N-glykanové analýzy a integrace online bioinformatických pipeline pro rychlé zpracování výsledků.

Závěr

Prezentované řešení HPAE-PAD-MS s kolonkou CarboPac PA300-4µm a PdH referenční elektrodou kombinuje rychlou, reprodukovatelnou chromatografii s vysokorozlišovací MS/MS a umožňuje bezderivatizační, vysoce informační charakterizaci O-glykanů mucinů.

Reference

1. Ohtsubo K., Marth J.D. Glycosylation in Cellular Mechanisms of Health and Disease. Cell 2006,126(5):855–867.
2. Burchell J.M. et al. O-Linked Glycosylation in the Mammary Gland. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 2001,6(3):355–364.
3. Thermo Scientific Technical Note 72478. Native N-linked oligosaccharide characterization by HPAE-PAD/MS.
4. Thermo Scientific Technical Note 73348. Carbohydrate determinations by HPAE-PAD using a PdH electrode.
5. Hayes C.A. et al. UniCarb-DB: A Database Resource for Glycomic Discovery. Bioinformatics 2011,27(9):1343–1344.
6. Ceroni A. et al. GlycoWorkbench: A Tool for Annotation of Mass Spectra of Glycans. J. Proteome Res. 2008,7(4):1650–1659.
7. Domon B., Costello C.E. Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in MS/MS. Glycoconj. J. 1988,5(4):397–409.
8. Brockhausen I. et al. O-GalNAc Glycans. In Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009.
9. Karlsson N.G. et al. Structural Determination of Neutral O-Linked Oligosaccharide Alditols by LC-ESI-MSn. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2004,15(5):659–672.
10. Schulz B.L. et al. Small-Scale Analysis of O-Linked Oligosaccharides by Gel Electrophoresis. Anal. Chem. 2002,74(23):6088–6097.