Analysis of Serum N-Glycans of Gene-KO Mouse Using MALDI-7090 and SialoCapper-ID Kit

Význam tématu

Proteinová glykosylace se podílí na řadě biologických procesů, přičemž sialové kyseliny na konci glykanů ovlivňují imunitní reakce, virovou infekci a nádorové procesy. Rozlišení izomerů dle vazby sialových kyselin je klíčové pro pochopení biologických mechanismů i pro diagnostiku.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat schopnost nového Sialic Acid Stabilizing kitu (SialoCapper™-ID Kit) v kombinaci s BlotGlyco® upravit a analyzovat N-glykany séra myší se záměrně vyřazenými geny pro sialyltransferasy. Analýza byla prováděna prostřednictvím MALDI-TOF-MS (MALDI-7090) bez nutnosti chromatografické separace nebo enzymatické hydrolýzy.

Použitá metodika a instrumentace

• Uvolnění N-glykanů: Denaturace glykoproteinů z myšího séra SDS, redukce DTT, štěpení PNGase F.
• Solid-phase derivatizace: Pomocí BlotGlyco® a SALSA protokolu v rámci SialoCapper-ID kitu byla prováděna vazebně specifická alkylamidace α2,3- a α2,6-sialových kyselin.
• Štěpení a označení: Sialylované glykany byly označeny 2-aminobenzoovou kyselinou (2-AA) a vyčištěny pomocí HILIC-SPE čipu.
• Hmotnostní spektrometrie: Analýza na MALDI-7090 v negativním reflektronovém módu s matricí DHB a následné MS2 pomocí vysoké energie CID s ASDF funkcí.

Hlavní výsledky a diskuse

• MS1 spektrometrie odhalila rozdíl 28 Da mezi izomery α2,3- a α2,6-sialylace. Vzory m/z 2080–3114 odpovídají diantennárním strukturám s diferencovaným počtem i typem sialových zbytků.
• Ve vzorcích ST6Gal1-KO a DKO chyběly signály α2,6-sialylace, což potvrzuje roli ST6Gal1 v její biosyntéze.
• MS2 analýza piku m/z 2749 z DKO ukázala ztrátu 348 Da, potvrzující přítomnost α2,6-derivované NeuGc, implicující alternativní enzymatickou aktivitu mimo ST6Gal1/2.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé a citlivé rozlišení sialových vazeb přímo hmotnostní spektrometrií bez LC nebo enzymatického kroku.
• Možnost provést purifikaci a derivatizaci glykanů v jednom kroku díky BlotGlyco® kuličkám.
• Využití MS2 dává spolehlivou verifikaci neočekávaných struktur.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na klinické a diagnostické aplikace při analýze glykokonjugátů.
• Vývoj dalších derivatizačních sad pro jiné druhy glykosidických vazeb.
• Integrace s kvantitativními technikami pro detailní profilování glykanačních změn v patologiích.

Závěr

Kombinace SialoCapper-ID kitu a BlotGlyco® s MALDI-7090 umožňuje efektivní a selektivní rozlišení sialových vazeb na glycanech bez komplikovaných separačních či enzymatických kroků. Přístup slibuje aplikace v glykoproteomice a dalších oblastech analytické chemie.

Reference

1. Ohmi Y. et al. Majority of alpha2,6-sialylated glycans in the adult mouse brain exist in O-glycans: SALSA-MS analysis for knockout mice of alpha2,6-sialyltransferase genes. Glycobiology, in press (2020).
2. Nishikaze T. et al. Differentiation of Sialyl Linkage Isomers by One-Pot Sialic Acid Derivatization for Mass Spectrometry-Based Glycan Profiling. Anal. Chem. 89, 2353–2360 (2017).
3. Hanamatsu H. et al. Sialic Acid Linkage Specific Derivatization of Glycosphingolipid Glycans by Ring-Opening Aminolysis of Lactones. Anal. Chem. 90, 13193–13199 (2018).