Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry for protein structural characterization

Význam tématu

Studium prostorové konformace a dynamiky proteinů je klíčové pro pochopení jejich funkce v biologických systémech. Klassické metody jako rentgenová krystalografie, NMR či kryo-EM poskytují statické pohledy na strukturu, ale nedokážou snadno zachytit dynamické změny ve vodném prostředí. HDX-MS (hydrogen deuterium exchange mass spectrometry) vyplňuje tuto mezeru, protože umožňuje sledovat výměnu vodíkových atomů za deuteria v reálném čase, čímž odhaluje flexibilní a solventně přístupné oblasti proteinů.

Cíle a přehled studie

Cílem této technické poznámky bylo demonstrovat plně automatizovaný HDX-MS workflow využívající Orbitrap Exploris 480 pro analýzu konformace modelového proteinu cytochromu c. Byla optimalizována sekvence kroků od vzorkování a značení během různých časových intervalů až po on-line štěpení, chromatografickou separaci a hmotnostní spektrometrii.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek cytochromu c (40 µM) byl ředěn ve směsi pD 7,4 a vystaven deuterovému značení při 4 °C v časových bodech od 30 s do 7200 s. Reakce byla následně zahuštěna na pH 2,2 a proteolyticky štěpena na koloně s immobilizovaným proteázou III/pepsinem při 2 °C. Peptidy byly zachyceny na C18 trap kolóně a separovány na analytické C18 kolóně při mikroprůtoku 40 µL/min s gradientem ACN/formiátu.

• Autosampler: H/D-X PAL (Trajan LEAP-HD-Automation) s teplotní kontrolou vzorku, štěpící hlavy a kolony
• LC systém: Thermo Scientific UltiMate NCS-3500RS (dual rapid separation a ternární loading pump)
• MS: Thermo Scientific Orbitrap Exploris 480, ESI v režimu pozitivního iontování, rozlišení 60 000, rozsah m/z 300–1300 (MS) a 200–2000 (MS/MS)
• Software: BioPharma Finder 3.2 a HDExaminer 2.5

Hlavní výsledky a diskuse

Bylo identifikováno přes 100 peptidů pokrývajících 99 % sekvence proteinu, z nich bylo vybráno 93 s nejvyšší reprodukovatelností pro výpočet inkorporace deutéria. Reprodukce chromatografického rozdělení byla velmi vysoká, což umožnilo přesné stanovení deuterace v čase. Dynamické posuny izotopických distribucí ukázaly očekávaný nárůst deuteriového obsahu v flexibilních oblastech. Díky překrývajícím se peptideům bylo dosaženo rozlišení na hladině jednotlivých zbytků (např. residua 55 a 62). Heat mapa deuterace a ochranné faktory mapované na krystalovou strukturu cytochromu c (PDB 1hrc) potvrdily, že alfa-helixy vykazují nižší výměnu oproti nekonformním smyčkám.

Přínosy a praktické využití metody

Plně automatizovaný HDX-MS protokol významně zvyšuje reprodukovatelnost a průchodnost analýzy proteinových konformací. Metoda je vhodná pro farmaceutický výzkum, vývoj bioterapeutik a charakterizaci interakcí protein–ligand. Umožňuje rychlou detekci konformačních změn způsobených modifikacemi, mutacemi či komplexováním.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se propojení HDX-MS s vysokoprůtokovými screeningovými platformami a další integrace s ion­tovými mobilitami. Rozvoj pokročilých algoritmů včetně umělé inteligence může vylepšit interpretaci a predikci ochranných faktorů. Metoda se bude uplatňovat při studiu kompletnějších supramolekulárních komplexů, membránových proteinů a dynamiky in vivo.

Závěr

Ukázali jsme, že plně automatizované HDX-MS uspořádání s Orbitrap Exploris 480 poskytuje robustní, vysoce reprodukovatelné a vysoce citlivé stanovení konformačních změn proteinů až na úroveň jednotlivých zbytků. Workflow je efektivní nástroj pro strukturální a dynamickou charakterizaci proteinů.

Reference

1. Houde D et al. Analysis of Protein Conformation and Dynamics by Hydrogen/Deuterium Exchange MS. Anal. Chem. 2009;81:2644–2651.
2. Rose RJ et al. Mutation of Y407 in the CH3 domain dramatically alters glycosylation and structure of human IgG. mAbs. 2013;5(2):219–228.
3. Mayne L et al. Many Overlapping Peptides for Protein Hydrogen Exchange Experiments by the Fragment Separation-Mass Spectrometry Method. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2011;22(11):1898–1905.
4. Hamuro Y et al. High-Resolution HDX-MS of Cytochrome c Using Pepsin/Fungal Protease Type XIII Mixed Bed Column. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2019;30(2):227–234.