Structural characterization of the therapeutic antibody and biosimilar product with hydrogen deuterium exchange mass spectrometry

Význam tématu

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) se stala klíčovým nástrojem pro analýzu strukturálních vlastností monoklonálních protilátek a jejich biosimilárů. Umožňuje sledovat dynamiku proteinů a jejich konformaci v řešení při minimální spotřebě vzorku, což je zásadní pro hodnocení biosimilarity a kvality bioterapeutik.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo předvést plně automatizovaný HDX-MS workflow založené na Orbitrap Exploris 480 pro komparativní analýzu konformace trastuzumabu a jeho biosimilárního produktu. Studie zahrnuje bottom-up přístup s online trávicí kolonkou a časově řízenou výměnou vodíku za deuterium.

Použitá metodika

Analýza probíhala za použití následujících kroků:

• Výměna vzorku (1:20) s deuterovaným Hepes pufrem při 10 °C v několika časových bodech (30 s až 4 h).
• Zastavení reakce přidáním chladicího kvenchingového pufru a online proteolytická digesce při 15 °C.
• Separační gradientní RP-HPLC na Acclaim PepMap C18 kolonkách.
• Měření MS v režimu data-dependent HCD MS2 a full scan pro neoznačené vzorky.
• Opakování experimentu v trojitém provedení pro statistickou validaci.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer
• H/D-X PAL (Trajan/LEAP-HD-Automation)
• Thermo Scientific UltiMate NCS-3500RS LC system
• Thermo Scientific Acclaim PepMap 100 a 300 C18 kolony
• Immobilizovaný proteáz III/pepsin NovaBioAssays
• BioPharma Finder 3.2 software
• HDExaminer 2.5 software

Hlavní výsledky a diskuse

• Bylo identifikováno přes 800 peptidů s >98% pokrytím sekvence pro obě řetězce (lehkou i těžkou).
• Pro výpočet deuterového uptake bylo použito 86 peptidů (lehký řetězec) a 264 peptidů (těžký řetězec).
• Profily deuterového uptake mezi trastuzumabem a biosimilárem se lišily méně než 4 % pro většinu peptidů.
• Volcanové grafy a statistická analýza nepotvrdily žádné významné rozdíly (p>0,01) napříč 6000 datovými body.
• Protektivní faktory na úrovni jednotlivých aminokyselin se téměř zcela překrývaly.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlou a citlivou kontrolu konformace biotherapeutik s vysokým rozlišením a automatizací. HDX-MS workflow je vhodné pro hodnocení biosimilarity, vývoj nových protilátek i stabilitní studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

Analýza HDX-MS se bude dále posouvat směrem k vyššímu rozlišení a integraci se strojovým učením, kombinaci s ion mobility spektrometrií a rozšíření na komplexní biokonjugáty či glykované formy.

Závěr

Plně automatizované HDX-MS řešení na Orbitrap Exploris 480 poskytlo robustní a vysoce reprodukovatelnou platformu pro komparativní studii trastuzumabu a jeho biosimiláru. Výsledky potvrzují téměř identickou konformaci obou proteinů a podporují aplikaci této metody v biopharmaceutickém výzkumu.

Reference

• Houde D. et al. Analysis of Protein Conformation and Dynamics by Hydrogen/Deuterium Exchange MS. Anal Chem. 2009, 81, 2644–2651.
• Rose R.J. et al. Mutation of Y407 in the CH3 domain dramatically alters glycosylation and structure of human IgG. mAbs. 2013, 5, 219–228.
• Mayne L. et al. Many Overlapping Peptides for Protein Hydrogen Exchange Experiments by the Fragment Separation-Mass Spectrometry Method. J Am Soc Mass Spectrom. 2011, 22, 1898–1905.
• Hamuro Y. et al. High-Resolution HDX-MS of Cytochrome c Using Pepsin/Fungal Protease Type XIII Mixed Bed Column. J Am Soc Mass Spectrom. 2019, 30, 227–234.
• Hageman T. et al. Reliable Identification of Significant Differences in Differential Hydrogen Exchange-Mass Spectrometry Measurements Using a Hybrid Significance Testing Approach. Anal Chem. 2019, 91, 8008–8016.
• Zhang Z. et al. Improved Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry Platform with Fully Automated Data Processing. Anal Chem. 2012, 84, 4942–4949.