Quantitation of N-Nitroso Hydrochlorothiazide in Losartan- Hydrochlorothiazide Tablets

Význam tématu

Analýza nitrosaminných nečistot v léčivých přípravcích je klíčová vzhledem k jejich potenciální genotoxicitě a regulovaným limitům příjmu. N-nitroso hydrochlo­rothiazid (N-nitroso HCTZ) patří mezi NDSRI (nitrosaminné související nečistoty) a je klasifikován jako třída IV podle FDA. Stanovení stopových hladin této nečistoty v kombinovaných table­tách losartanu a HCTZ zabezpečuje kvalitu, bezpečnost a splnění legislativních požadavků farmaceutických výrobků.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo vyvinout citlivou, přesnou a reprodukovatelnou metodu MRM LC-MS/MS pro kvantifikaci N-nitroso HCTZ v tabletách obsahujících 100 mg losartanu a 25 mg HCTZ. Metoda měla dosáhnout nízkých limitů detekce a kvantifikace, vynikající linearity a širokého rozmezí kalibrace pro analýzu nečistot v hotové formě léčiva.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly připraveny rozpuštěním přesně odváženého tabletového prášku v methanolovém diluentu a extrahovány vortexem a odstředěním. Kalibrační řada zahrnovala deset bodů od 10 pg/mL do 10 ng/mL. Instrumentace zahrnovala systém Agilent 1290 Infinity II LC spojený s Agilent 6495D Triple Quadrupole MS.

Hlavní chromatografické podmínky:

• Kolona Agilent ZORBAX SB C18, 4,6×150 mm, 5 µm
• Mobilní fáze A: 1 mM fluorid amonný ve vodě; B: acetonitril
• Gradientní eluce, průtok 0,3 mL/min, teplota kolony 40 °C
• Objem injekce 20 µL

Parametry MS zdroje a MRM přechodu:

• Ionizace AJS v negativním režimu
• Prekurzor m/z 325, fragment ion m/z 293,9, CE 20 V
• Teplota plynu 275 °C, průtok 11 L/min, napětí kapiláry 2 500 V

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla LOD 5 pg/mL a LOQ 10 pg/mL, s poměrem S/N 121:1 na úrovni LOQ. Lineární závislost signálu na koncentraci byla potvrzena v rozsahu 10 pg/mL až 10 ng/mL s R² = 0,9951 (1/x vážení). Reprodukovatelnost byla ověřena sedmi opakovanými injekcemi na úrovni LOQ s %RSD 2,7 %. Spike recovery ukázala průměrnou návratnost 114,35 % ve vzorcích placeba a 93,85 % v tabletách. Analýza tabletových i API roztoků nepotvrdila přítomnost N-nitroso HCTZ nad LOQ v nezaspíko­vaných vzorcích.

Přínosy a praktické využití metody

Vyvinutá metoda nabízí vysokou citlivost a specifitu pro rutinní kontrolu nečistot v rámci QA/QC laboratoří farmaceutického průmyslu. Automatizované směrování eluktu diverterem minimalizuje interferenci hlavních složek API a zlepšuje kvalitu dat. Systém je vhodný pro validaci podle farmaceutických norem a splňuje regulační limity nitrosaminů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda může být rozšířena pro další genotoxické nitrosaminy a jiné třídy nečistot v různých formách léčivých přípravků. Vzhledem k rostoucím požadavkům na vyšší propustnost a ekologičtější analytiku lze implementovat rychlejší gradientní protokoly, miniaturizaci kolony či alternativní zdroje ionizace. Integrace s moderními softwarovými nástroji pro pokročilou kvantitativní analýzu podpoří vývoj víceparametrických screened metod.

Závěr

Byla úspěšně vyvinuta robustní a vysoce citlivá MRM LC-MS/MS metoda pro stanovení N-nitroso HCTZ v kombinovaných tabletách losartanu a HCTZ. Metoda splňuje přísné limity detekce a kvantifikace, vykazuje vynikající linearitu, reprodukovatelnost a návratnost spikovaných vzorků. Díky efektivní chromatografické separaci a optimalizovaným zdrojovým podmínkám je vhodná pro rutinní nasazení v kontrolních laboratořích.

Reference

• Mastovska K.; Zulkoski J.; Zweigenbaum J. Triggered MRM LC/MS/MS Method Development – Practical Considerations for MRM Optimization Using Agilent MassHunter Optimizer Software. Agilent Technologies technical overview 2017, publication number 5991-7195EN.
• Sosienski T.; Covert K. Trace-Level Quantification of Potential Mutagenic Impurities in Pharmaceuticals. Agilent Technologies application note 2019, publication number 5994-1238EN.
• Joseph P.; Banerjee S.; Vyas S. Determination of Genotoxic Nitrosamine Impurity in Bumetanide API and Tablets Using the Agilent 6470 Triple Quadrupole LC/MS. Agilent Technologies application note 2020, publication number 5994-2967EN.