A Rapid UPLC™-MS/MS Method for the Quantification of PROTACs-3-Gefitinib and Urinary Metabolites Following Subcutaneous Administration to Male Rats

Význam tématu

PROTAC jsou inovativní malé molekuly schopné navádět ubiquitin–proteasomální systém ke specifickému odstranění cílových bílkovin. To přináší výhodu úplné eliminace proteinu, omezení rezistence vůči léčivu a umožňuje zacílení doposud neléčitelných proteinů. Klíčovou součástí vývoje těchto látek je pochopení jejich farmakokinetiky a metabolismu in vivo, včetně kvantifikace původní molekuly i vzniklých metabolitů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout rychlou a citlivou UPLC–MS/MS metodu pro současné stanovení PROTAC-3-gefitinibu a jeho hlavních močových metabolitů po subkutánním podání samčím potkanům v dávce 10 mg kg−1. Studie demonstruje schopnost metody kvantifikovat jak nízké, tak vysoké koncentrace analytů bez nutnosti dalŠích ředění nebo opakovaných reanalýz.

Použitá metodika

Vzorky moči byly připraveny proteinovou precipitací acetonitrilem : methanolem (4 : 1) s vnitřním standardem gefitinib-d6. Po víření a centrifugaci byl supernatant analyzován UPLC–MS/MS.

Použitá instrumentace

• UPLC systém ACQUITY Premier s binárním gradientem
• Kolona ACQUITY Premier HSS T3, 2.1 × 100 mm, 1.8 µm při 60 °C
• Xevo TQ Absolute tandemový kvadrupólový hmotový spektrometr v pozitivní ESI MRM režimu
• Softwarové nástroje MassLynx 4.2 a TargetLynx XS

Hlavní výsledky a diskuse

Pomocí HRMS byly identifikovány sedm hlavních metabolitů vznikajících N-dealkylací, amidohydrolýzou i konjugacemi sulfatů a glukuronidů. Cílená UPLC–MS/MS metoda sledovala šest klíčových metabolitů (M1, M4, M6, M7, M8, M9) a původní PROTAC-3-gefitinib. Kalibrace v rozmezí 1–1000 ng mL−1 vykázala lineární závislost s korelačním koeficientem r2 = 0.9987. Retenční časy se pohybovaly mezi 1.94 a 3.29 min a dosažené špičkové chromatografické tvary zajišťovaly vysokou specifitu a reprodukovatelnost.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost i široký lineární rozsah bez potřeby ředění vzorků
• Rychlá separace díky UPLC Premier a minimalizace nespecifického navázání analytů
• Podpora 3R principů díky analýze malých objemů moči
• Jednoduchá příprava vzorků a efektivní kvantifikace více analytů v jednom běhu

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda lze rozsáhnout na analýzu PROTAC v plazmě, tkáních i lidských vzorcích. Dalšími perspektivami je integrace do komplexních farmakokinetických a biotransformačních studií a adaptace na vysoce průtokové a multiplexní platformy.

Závěr

Vyvinutá UPLC–MS/MS metoda prokázala schopnost rychlé, citlivé a spolehlivé kvantifikace PROTAC-3-gefitinibu a jeho metabolitů v moči samčích potkanů. Široký dynamický rozsah a vysoké rozlišovací schopnosti podpořily detailní sledování farmakokinetiky a eliminace těchto inovativních léčiv.

Reference

• Kenten JH a Roberts SF. Controlling Protein Levels in Eucaryotic Organisms. US Patent US6306663B1.
• Goracci L, Desantis J, Valeri A a kol. Understanding the Metabolism of Proteolysis Targeting Chimeras. J Med Chem. 2020;63(20):11615–11638.
• Molloy BJ a kol. Rapid Determination of Pharmacokinetics and Metabolic Fate of Gefitinib in Mouse. Xenobiotica. 2021;51:434–446.
• McKillop D a kol. Metabolic Disposition of Gefitinib in Rat, Dog, and Man. Xenobiotica. 2004;34:917–934.
• Liu X a kol. Metabolomics Reveals Formation of Aldehydes and Iminium in Gefitinib Metabolism. Biochem Pharmacol. 2015;97:111–121.
• Waters Application Note 720008229. Rapid LC–MS/MS Bioanalytical Method for Quantification of Gefitinib-Based PROTACs. 2024.