Rapid, High Sensitivity Quantification of a Proteolysis Targeting Chimera, PROTAC, in Rat Plasma From a Microsampling DMPK Study Using UPLC-MS/MS

Význam tématu

Proteolysis-targeting chiméry (PROTAC) představují průlomovou třídu cílených léčivých molekul schopných navádět systém buněčného proteasomu k degradaci patologických proteinů. Jejich specifita a potenciál překonat omezení konvenčních malých molekul zvyšují potřebu přesných bioanalytických metod pro stanovení farmakokinetiky během preklinického a klinického vývoje. Mikrovzorkování navíc umožňuje snížit objem odebírané krve od pokusných zvířat, čímž se prosazují principy 3R (replacement, reduction, refinement) v toxikologii a DMPK studiích.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat rychlou vysoce citlivou UPLC–MS/MS metodu pro kvantifikaci modelového PROTACu založeného na gefitinibu v plazmě potkanů po subkutánním podání. Použito bylo mikrovzorkování sérií krevních odběrů z Wistar potkanů (10 mg/kg), s cílem určit farmakokinetické parametry molekuly.

Použitá metodika a instrumentace

Pro extrakci analyzovaného exempláře z plazmy byla nasazena pevná fáze SPE (Oasis HLB). Chromatografie probíhala na systému ACQUITY Premier UPLC s kolonou HSS T3 2.1×100 mm, 1.7 μm, při teplotě 60 °C a průtoku 0.6 mL/min za gradientu 0.1 % kyseliny formiové v kombinaci s acetonitrilem. Detekce byla zajištěna tandemovým kvadrupólovým spektrometrem Xevo TQ Absolute v režimu pozitivního ESI-MRM. Kvantifikace proběhla za pomoci stabilně značeného vnitřního standardu gefitinib-d6.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla lineárního rozsahu 0.25–500 ng/mL (r2=0.987) a limitu detekce 100 fg na kolonu. ACQUITY Premier technologie s inertním povrchem potlačila nespecifické interakce analytu s kovovými částmi systému, což vedlo k ostřejším a symetričtějším chromatografickým píkům. Po subkutánním podání dosáhlo PROTACu maximální průměrné koncentrace 71.8 ng/mL v 6. hodině, eliminace následovala poločasem 7.2 h a molekula zůstala detekovatelná i po 24 h.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá příprava vzorku s minimálním objemem plazmy (20 µL).
• Velmi vysoká citlivost umožňující sledovat nízké koncentrace v mikrovzorcích.
• Široký dynamický rozsah vhodný pro sledování farmakokinetiky v celém časovém profilu.
• Inertní chromatografický systém s minimalizací adsorpce analytu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj se zaměří na rozšíření aplikace na různé typy PROTAC molekul a jejich metabolitů, integraci vysokoúčinných mikrovzorkovacích technik a automatizaci přípravy vzorků. Zároveň se očekává nasazení vyspělé spektrometrie s vyšším rozlišením (HRMS) pro charakterizaci degradačních produktů.

Závěr

Popisovaná UPLC–MS/MS metoda kombinuje vysokou citlivost, spolehlivost a efektivitu pro kvantifikaci PROTAC molekul v mikrovzorcích potkaní plazmy. Technologie ACQUITY Premier zajišťuje robustní chromatografii bez ztrát signálu způsobených interakcemi s kovovými povrchy, což je klíčové pro bioanalytiku nových terapeutik.

Reference

• Békés M, Langley DR, Crews CM. PROTAC targeted protein degraders: the past is prologue. Nat Rev Drug Discov. 2022;21:181–200.
• O’Brien Laramy MN et al. Delivering on the promise of protein degraders. Nat Rev Drug Discov. 2023;22:410–427.
• Xiao M et al. Recent Advances of Degradation Technologies Based on PROTAC Mechanism. Biomolecules. 2022;12:1257.
• Kenten JH, Roberts SF. US Patent US6306663B1.
• Mullard A. First targeted protein degrader hits the clinic. Nat Rev Drug Discov. 2019;18:237–239.