Improved and universal inline electrochemical reduction and subunits LC-MS analysis of multiple classes of monoclonal antibodies

Význam tématu

Rychlá a univerzální inline elektrochemická redukce monoklonálních protilátek významně zjednodušuje přípravu vzorku pro LC MS středně rozdělenou analýzu subjednotek bez použití klasických redukčních činidel. Tato přístupná metoda podporuje rychlé monitorování struktury a modifikací mAb v bioprodukčním i kontrolním prostředí.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat optimalizované workflow pro inline redukci intactních mAb a subjednotek vzniklých Enzymem IdeS a následnou LC MS analýzu. Metoda měla být účinná pro různé třídy IgG (IgG1, IgG2, IgG4) a zachovat kyseliny citlivé na kyselé podmínky, například sialylované N glycany.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow zahrnuje elektrochemickou cellu µ-PrepCell SS s potenciostatem ROXY Exceed propojenou s Vanquish Tandem LC systémem a Q Exactive Plus Orbitrap hmotnostním spektrometrem. Použita byla MAbPac RP kolona pro zachycení a oddělení subjednotek. Enzymatické štěpení IdeS se realizovalo na cetuximabu následované inline elektrochemickou redukcí při 1 V a 60 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizované podmínky umožnily kompletní redukci Lc, Hc, Fd a scFc během 23,5 minuty. Metoda byla ověřena na NIST mAb standardu a komerčních protilátkách rituximab (IgG1), denosumab (IgG2) a nivolumab (IgG4). Data ukázala zachování isotopického rozlišení, konzistentní detekci glykoform a neovlivnění křehkých modifikací. Analýza cetuximabu prokázala spolehlivou kvantifikaci sialylovaných glykoform.

Přínosy a praktické využití metody

• Eliminace chemických redukčních činidel a souvisejících očistných kroků
• Zkrácení doby analýzy a zlepšení reproducibility
• Univerzální aplikace na různé podtřídy mAb
• Zachování acid labile modifikací jako sialylace

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda má potenciál pro plnou automatizaci QC procesů v biotechnologickém průmyslu, rozšíření na další bioterapeutika a integraci s pokročilými hyphenovanými technikami. Další vývoj může zahrnovat inline modifikace workflow pro simultánní analýzu dalších posttranslačních modifikací.

Závěr

Inline elektrochemická redukce a střední rozdělení subjednotek mAb přímo v chromatografické cestě představuje rychlý, univerzální a šetrný přístup pro detailní strukturální charakterizaci monoklonálních protilátek bez použití chemických činidel. Workflow o délce 23,5 minuty minimalizuje riziko ztráty křehkých modifikací a zvyšuje efektivitu laboratorních analýz.

Reference

1. Morgan TE et al. Analyst 2021;146(21):6547-6555
2. Füssl F et al. Anal Chem 2020;92(7):5431-5438
3. Ayoub D et al. mAbs 2013;5(5):699-710