SMART Digest compared to classic in-solution digestion of rituximab for in-depth peptide mapping characterization

Význam tématu

Peptidové mapování monoklonálních protilátek je klíčové pro ověření identity, stability a kvality biotechnologických léčiv. Rychlá a reprodukovatelná příprava vzorku s minimálním počtem analýzou indukovaných artefaktů usnadňuje rutinní kontroly kvality (QA/QC) a výzkumné aplikace.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat novou metodu SMART Digest™ pro enzymatickou digesci monoklonální protilátky rituximab s tradičními in-solution postupy. Hodnoceny byly tyto parametry:

• Sekvenční pokrytí těžkého a lehkého řetězce mAb
• Identifikace a relativní kvantifikace posttranslačních modifikací (deamidace, oxidace, glykosylace, karbamylace)
• Reprodukovatelnost a časová úspora při přípravě vzorku

Použitá metodika a instrumentace

Proti klasické in-solution digesci (denaturace v 7 M ureu nebo zahřátím při 70 °C) byla testována metoda SMART Digest s imobilizovaným trypsinem při 70 °C po dobu 15, 30, 45 a 75 min.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Thermo Scientific™ Vanquish™ Flex Quaternary system
• Kolona: Thermo Scientific™ Acclaim™ VANQUISH™ C18, 2.2 μm, 2.1×250 mm
• Mobilní fáze: A = voda + 0.1 % FA, B = voda/acetonitril (20:80 v/v) + 0.1 % FA, 0.3 mL/min, 50 °C
• MS: Thermo Scientific™ Q Exactive™ HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap™, režim DDA (Full MS 60 000, MS2 15 000 FWHM)
• Software: Chromeleon™ 7.2 SR4, BioPharma Finder™ 1.0 SP1

Hlavní výsledky a diskuse

Všechny testované metody dosáhly 100% sekvenčního pokrytí těžkého i lehkého řetězce rituximabu. SMART Digest umožnil kompletní digesci během 15 min, zatímco konvenční způsoby vyžadovaly přes noc. Reprodukovatelnost (RSD plochy vybraných peptidů) byla u SMART Digest < 5 %. Celkový iontový proud (TIC) a počet identifikovaných komponent byly mezi metodami srovnatelné, nicméně SMART Digest vykázal mírně vyšší počet peptidů a nižší úroveň karbamylace díky vynechání urey.

Posttranslační modifikace (n = 85) se ve všech podmínkách vyskytovaly obdobně. Nejčastějšími PTM byly:

• Glykosylace Asn301 vysokourovňovými glykany (A2G0F, A2G1F, A2G2F)
• Deamidace vybraných Asn (N319, N388) – nejnižší při SMART Digest 15 min
• Oxidace Met a Trp – mírný nárůst pouze při dlouhodobé digesci

Digesce při zvýšené teplotě a pH 7.2 minimalizovala indukovanou deamidaci a karbamylaci ve srovnání s alkalickou in-solution urea metodou.

Přínosy a praktické využití metody

SMART Digest přináší:

• Výrazné zkrácení času přípravy vzorku (až z ~16 h na 15 min)
• Vyšší reprodukovatelnost a snížení procesních artefaktů
• Snadnou automatizaci a kompatibilitu s vysokopropustnými platformami UHPLC–MS
• Minimalizaci chemických modifikací (karbamylace, nadměrné deamidace)

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj:

• Standardizovaných přípravných kitů pro různé třídy proteinů
• Integrace s plně automatizovanými a online workflow
• Pokročilé softwarové nástroje s umělou inteligencí pro rychlou analýzu dat a predikci modifikací
• Rozšíření na komplexní proteomické aplikace a kvalifikaci biosimilars

Závěr

SMART Digest nabízí rychlou, vysoce reprodukovatelnou a komplexní digesci monoklonálních protilátek srovnatelnou či lepší než tradiční in-solution metody. Díky výraznému zkrácení času a redukci nežádoucích modifikací je ideální pro rutinní peptidové mapování v biopharmaceutických laboratořích.

Reference

• Ren D., Pipes G.D., Liu D., Shih L.-Y., Nichols A.C., Treuheit M.J., Brems D.N., Bondarenko P.V. An improved trypsin digestion method minimizes digestion-induced modifications on proteins. Analytical Biochemistry. 2009;392:12–21.
• Thermo Scientific SMART Digest Kit Technical Guide. Runcorn, UK; 2015.
• Thermo Scientific Application Note 21198: Improvement in Speed and Reproducibility of Protein Digestion and Peptide Quantitation Utilizing Novel Sample Preparation Technology in a Full Solution Workflow. Runcorn, UK; 2015.
• Nebija D. et al. Comparison of two-dimensional gel electrophoresis patterns and MALDI-TOF MS analysis of therapeutic recombinant monoclonal antibodies trastuzumab and rituximab. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2011;56:684–691.
• Kollipara L., Zahedi R.P. Protein carbamylation: in vivo modification or in vitro artefact? Proteomics. 2013;13:941–944.
• Dick L.W., Mahon D., Qiu D., Cheng K.C. Peptide mapping of therapeutic monoclonal antibodies: Improvements for increased speed and fewer artifacts. Journal of Chromatography B. 2009;877:230–236.
• Visser J., Feuerstein I., Stangler T., Schmiederer T., Fritsch C., Schiestl M. Physicochemical and Functional Comparability Between the Proposed Biosimilar Rituximab GP2013 and Originator Rituximab. BioDrugs. 2013;27:495–507.