There is More to HPLC Than Reverse Phase - Column choices: Have you thought about the rest?

Význam tématu

Metody kapalné chromatografie založené na reverzní fázové separaci (RP-HPLC) jsou v laboratořích široce rozšířené, ale v řadě aplikací nemusí poskytovat optimální retenci či selektivitu. Alternativní chromatografické techniky a různé typy stacionárních fází rozšiřují možnosti separace polárních látek, stereochemických forem, proteinů či biologicky aktivních makromolekul. Znalost a využití těchto ortogonálních přístupů vede ke zkrácení doby analýzy, zlepšení rozlišení, zvýšení robustnosti metod a snížení environmentální zátěže.

Cíle a přehled článku

Článek "There is More to HPLC Than Reverse Phase" si klade za cíl představit výhody a principy ostatních technik kromě běžné C18 jako jsou superkritická tekutinová chromatografie (SFC), iontově výměnná (IEX), hydrofobní interakční (HIC), velikostně vylučovací (SEC) a afinitní chromatografie. Autor popisuje vhodné sloučeniny, podmínky i stacionární fáze pro rozmanité aplikace včetně chirálních separací.

Použitá metodika

Analytická práce se opírá o srovnávání různých sloučenin stacionárních fází (C8, C18, HILIC, CN, fenyl-hexyl) a chemie SFC využívající CO2 s organickými modifikátory. Pro proteiny a makromolekuly byly testovány HIC i IEX kolony s různou pórovitostí a částicovou velikostí. V SEC byly porovnány kolony různé pórů pro rozlišení monomerů, dimerů a fragmentů. Chiralita byla řešena na derivatizovaných cyklofuranózách, cyklodextrinech a antibiotických stacionárních fázích.

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity hybrid SFC/UHPLC
• Single quadrupole MS detektor
• Kolony: Agilent InfinityLab, ZORBAX, Poroshell 120, Bio-Monolith, AdvanceBio HIC, Bio IEX, PL-SAX/SCX, AdvanceBio SEC

Hlavní výsledky a diskuse

• SFC se superkritickým CO2 umožňuje až trojnásobné zkrácení doby analýzy bez ztráty efektivity díky nízké viskozitě a vysoké difuzivitě.
• HIC kolony AdvanceBio selektivně rozlišují proteiny a jejich varianty v nativním stavu, optimalizovaný gradient soli zajišťuje ostřejší špičky i nižší provozní tlak.
• IEX kolony s neporózními částicemi Bio IEX poskytují vysoké rozlišení při rychlejší hmotové výměně, menší velikost částic zkracuje dobu separace.
• SEC sloupce AdvanceBio SEC 200 Å 1,9 µm vykazují lepší rozlišení monomer/dimer a fragmentů oproti konkurenčním kolům, nižší šířky špiček a akceptovatelný tlak.
• Chiralita byla úspěšně demonstrována na Poroshell Chiral CF, CD, V a T, pokrývajících široké spektrum enantiomerů za různých mobilních fází (polar-ionický, reverzní, normal-phase).

Přínosy a praktické využití metody

• Zlepšená selektivita umožňuje analýzu polárních sloučenin, stereoisomerů a biologických makromolekul.
• Rychlejší separace s nižšími spotřebami organických modifikátorů přispívají k vyšší laboratorní kapacitě a ekologičtějšímu provozu.
• Možnost kombinace více technik na jednom systému (SFC/UHPLC) zjednodušuje workflow a snižuje investiční náklady.
• Robustnost a opakovatelnost kolonek pro QC mAb, ADC, proteinovou a chirální analýzu přináší lepší kvalitu validace metod.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace SFC s HR-MS pro screening knihoven potenciálních léčiv.
• Další rozvoj monolitických sorbentů s vyšší propustností a odolností.
• Využití AI a machine learning pro predikci optimální stacionární fáze a podmínek separace.
• Šetrné chromatografické přístupy s minimem toxických rozpouštědel a obnovitelnými zdroji CO2.

Závěr

Diversifikace chromatografických metod nad rámec klasické reverzní fáze přináší výrazné výhody v selektivitě, rychlosti a environmentální stopě. Výběr vhodné stacionární fáze a techniky (SFC, IEX, HIC, SEC, chirální) by měl být vždy řízen cíli analýzy, složitostí vzorku a praktickými požadavky QC laboratorních provozů.