Thinking Outside the C18 Box

Význam tématu

V oblasti kapalinové chromatografie je nejčastěji používanou metodou reverzní fázová HPLC s C18 fází. Nicméně rostoucí požadavky na analýzu polárních sloučenin, jako jsou vitaminy, aminokyseliny či sacharidy, vyžadují uplatnění alternativních separačních režimů. Volba vhodné chromatografické strategie zvyšuje robustnost metod, rozšiřuje možnosti detekce a zlepšuje citlivost, což je klíčové v rutinní kvalitativní a kvantitativní analýze ve výzkumu i v průmyslovém prostředí.

Cíle a přehled studie / článku

Text poskytuje ucelený přehled hranic tradiční C18 chromatografie a představuje alternativní přístupy: iontově párovanou chromatografii, HILIC a specializované fázové chemie Agilent InfinityLab Poroshell 120 (C18, C8, Phenyl-Hexyl, PFP a řady HILIC). Příkladem je separace vodou rozpustných vitaminů, alifatických kyselin, aminokyselin či sacharidů.

Použitá metodika a instrumentace

Studie využívá moderní UHPLC sloupce Agilent InfinityLab Poroshell 120 s částicemi 1,9–4 μm a hybridní konstrukcí superficially porous. Zmíněny jsou:

• Reverzní fáze C18, C8, SB fází a odolné HPH fází pro vyšší pH
• Iontově párovaná chromatografie s alkylsulfonáty či kvartérními aminy
• HILIC fáze: silika, amide, zwitteriontní (HILIC-Z), hydroxylová (HILIC-OH5)
• Detekce DAD (210–260 nm), ELSD pro sacharidy a ESI-MS/MS pro aminokyseliny

Hlavní výsledky a diskuse

Reverzní fáze C18 při nízkém pH selhává u 4 ze 10 vodou rozpustných vitaminů kvůli nízkým retenčním faktorům (k′ < 2) a koeluci. Úprava pH na cca 7,5 vede k úplné ztrátě retence kyselých vitaminů. Iontově párovaná metoda s heptansulfonátem významně zlepšila retenční časy a rozlišení, avšak vyžaduje pečlivou kontrolu složení mobilní fáze a dedikovaný sloupec. HILIC režim ukázal vynikající retenční vlastnosti a selektivitu pro vitaminy i sacharidy, přičemž izokratické metody a gradienty (90–60 % ACN) umožňují rychlou analýzu do 5 minut. V HILIC režimu byla demonstrována i vysoká efektivita při použití slabě iontových mobilních fází a nízkých teplot pro optimalizaci separace vitaminu C.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost simultánní analýzy polárních kyselin, vitaminů, aminokyselin a sacharidů
• Vysoká citlivost a šíře lineární oblasti při detekci MS či ELSD
• Alternativní selektivita oproti RPLC pro složité matrice (farmaceutika, potraviny, biochemie)
• Rychlé jednokrokové protokoly s vysokým podílem organické složky, nižší tlak a lepší obnovitelnost kolony

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozvoj multifunkčních fází kombinujících HILIC a iontovou výměnu, širší využití UHPLC-MS/MS ve farmakovigilanci a metabolomice, dále miniaturizace analytických systémů a automatizace přípravy vzorků včetně SPE-HILIC integrace. Nové hybridní částice a povrchové protonové fázové chemie otevřou cesty k selektivním monomerickým interakcím a ultrarychlým separacím.

Závěr

Problémy s retenčními charakteristikami C18 fází lze řešit optimalizací pH, iontově párovanou chromatografií či přechodem na HILIC. Moderní Poroshell 120 kolony poskytují širokou paletu fází pro různé pH a selektivity, přičemž HILIC režim vyniká v analýze vysoce polárních sloučenin. Volba vhodného režimu a pečlivá kontrola parametrů (složení, teplota, pH) zaručují spolehlivé a efektivní separace.

Reference

• Przybyciel, T.; Majors, R. LCGC, 20(6), 516–523 (2002).