Rapid High Sensitivity LC-MS/MS Bioanalytical Method for the Simultaneous Quantification of Gefitinib Based PROTACs – 3 and Gefitinib in Rat Plasma to Support Discovery DMPK Studies

Význam tématu

Proteolysis targeting chiméry (PROTACs) představují inovativní přístup v návrhu léčiv, který překonává rezistenci malých molekul a rozšiřuje počet cílových proteinů způsobilých k terapii. Vysoce citlivá kvantifikace PROTACs v biologických matricích je klíčová pro hodnotění farmakokinetiky a metabolismu v raných fázích vývoje. Tento článek popisuje rychlou LC-MS/MS metodu umožňující současné měření gefitinibu a jeho PROTAC derivátu v plazmě potkana s detekčním limitem v řádu pikogramů.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a validovat čtyřminutovou LC-MS/MS bioanalytickou metodu pro simultánní stanovení gefitinibu a gefitinib-Based PROTACs-3 v ratí plazmě. Metoda má podporovat DMPK studie zaměřené na farmakokinetiku nových PROTAC molekul při rozsahu 20 pg/mL až 1 000 ng/mL.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky plazmy byly připraveny srážením bílkovin acetonitrilem (poměr 1:3), do supernatantu byl přidán interní standard gefitinib-d6. Chromatografie probíhala na ACQUITY UPLC I-Class se sloupcem HSS T3 C18 (2.1×50 mm, 1.7 μm) při 60 °C. Mobilní fáze tvořilo 0.1 % kyseliny mravenčí v 1 mM amonném formiátu (A) a acetonitril s 0.1 % kyseliny mravenčí a 1 mM formiátu (B); gradient z 5→95 % B za 2 min s dvouminutovou isokratickou periodou. Separované složky byly detekovány na Xevo TQ-XS (ESI+), sledované MRM přechody: 934.33→617.34 pro PROTACs-3, 447.25→128.20 pro gefitinib a 453.16→134.2 pro interní standard. Data zpracováno softwary MassLynx V4.2 a TargetLynx XS.

Hlavní výsledky a diskuse

Limit detekce PROTACs-3 dosáhl 20 pg/mL (2.5 fg na kolonu), lineární dynamický rozsah 20 pg/mL–1 000 ng/mL (r2=0.998). Pro gefitinib byl LOD 0.05 ng/mL s linearitou 0.5–1 000 ng/mL (r2=0.997). Třídenní validační studie pro QCdávky 3, 75 a 800 ng/mL ukázala přesnost a opakovatelnost CV ≤5 %. Stabilita při třech cyklech zmraz-rozmraz byla v akceptovatelných mezích.

Přínosy a praktické využití metody

• Extrémně nízké LOD/LOQ umožňuje sledovat farmakokinetiku PROTACs po nízkých dávkách.
• Krátký analýzní čas (4 min) zvyšuje průchodnost vzorků.
• Simultánní stanovení gefitinibu a PROTAC derivátu zjednodušuje workflow v DMPK laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj LC-MS/MS metod pro analyty s vysokou molekulovou hmotností přes 1 000 Da. Integrace ion mobility separace může dále zvýšit selektivitu a rozlišení metabolit. Metoda lze adaptovat pro další PROTAC chemotypy či biologické matricové matice (tkáňové extrakty, moče).

Závěr

Vyvinutá rychlá LC-MS/MS metoda dosahuje vysoké citlivosti a robustnosti pro současné stanovení gefitinibu a gefitinib-Based PROTACs-3 v plazmě potkana. Validace prokázala lineární rozsah přes pět řádů, nízký LOD a vynikající reprodukovatelnost, což metodě umožňuje podporovat výzkum a vývoj PROTAC molekul v DMPK studiích.

Reference

1. Bhole RP et al. PROTACs: A Comprehensive Review of Protein Degradation Strategies in Disease Therapy. Bioorg Chem. 2023;139:106720.
2. Békés M, Langley DR, Crews CM. PROTAC Targeted Protein Degraders: The Past Is Prologue. Nat Rev Drug Discov. 2022;21(3):181–200.
3. McKillop D et al. Metabolic Disposition of Gefitinib in Rat, Dog and Man. Xenobiotica. 2004;34(10):917–34.
4. Molloy B et al. Pharmacometabodynamics of Gefitinib After IV Administration to Mice: UPLC-IM-MS Study. Metabolites. 2021;11(6):379.
5. FDA. Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry. May 2018.