HPLC Analysis of Ashwagandha Supplements Using Alliance™ iS HPLC System

Význam tématu

Ashwagandha (Withania somnifera) je ceněná rostlina s četnými farmakologickými aktivitami, zejména díky skupině steroidních laktonů nazývaných withanolidy. Tyto bioaktivní látky se využívají pro své protizánětlivé, neuroprotektivní, antioxidační či antidepresivní účinky. Spolehlivá kvalifikace a kvantifikace těchto sloučenin je zásadní pro zajištění kvality doplňků stravy a bezpečnosti jejich uživatelů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a validovat postup založený na HPLC metodě podle směrnice AOAC 2015.17 pro oddělení a stanovení šesti hlavních withanolidů extrahovaných z kořene ashwagandhy a komerčně dostupných doplňků pomocí systému Alliance iS HPLC.

Použitá metodika a instrumentace

Pro stanovení standardů byly připraveny pracovní roztoky každého withanolidu o koncentracích 50–200 µg/mL v methanolu. Mobilní fáze A tvořil roztok 0,136 g KH₂PO₄ ve 1000 mL vody s 0,5 mL ortho-fosforečné kyseliny, filtrovaný a odplyněný.
Pro extrakci se porovnávaly dvě varianty přípravy vzorků:

• Refluxní extrakce (vzorek zahříván ve vodní lázni při 50 °C, následná centrifugace a filtrace).
• Ultrazvukem asistovaná extrakce v sonické lázni s 30minutovou inkubací.

Optimální výtěžnost byla dosažena v ultrazvukem asistované extrakci s rozpouštědlovou směsí ethanol : methanol : voda (60 : 30 : 10).
Instrumentace:

• Alliance iS HPLC System (Waters Corporation)
• Chromatografická kolona vhodná pro separaci withanolidů
• UV/VIS detektor
• Sonikátor pro ultrazvukovou extrakci
• Centrifuga a PVDF filtr 0,2 µm
• Systém pro úpravu vody (Milli-Q)

Hlavní výsledky a diskuse

Systémová vhodnost (SST) splnila kritéria AOAC 2015.17: opakovatelnost, rozlišení, tubulární ohyb a linearita kalibračních křivek (R² ≥ 0,999).
Ekstrakce ultrazvukem prokázala lepší výtěžnost (1,0–4,7 mg/z 5 mg analyzované látky) ve srovnání s konvenčními metodami. Doba sonikace 30 min byla optimální – delší doba nepřinesla další zvýšení výtěžnosti.
Vzorové analýzy ukázaly, že v USP standardu kořene se koncentrace jednotlivých withanolidů pohybovaly od 0,2 do 0,8 % (hm./hm.). V komerčních doplňcích byly některé sloučeniny detekovány v nižších množstvích, mnohdy nebyly přítomny všechny cílové látky.

Přínosy a praktické využití metody

• Robustní a reprodukovatelná HPLC metoda pro kontrolu kvality ashwagandha doplňků.
• Optimalizovaná ultrazvuková extrakce s vysokou výtěžností.
• Schopnost odhalit variabilitu obsahu účinných látek v komerčních vzorcích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace hyphenovaných technik (UHPLC-MS/MS) pro vyšší selektivitu a citlivost.
• Automatizace přípravy vzorků a on-line extrakce pro zvýšení propustnosti laboratoře.
• Vývoj zelených extrakčních postupů, např. mikrovlnou asistované solvenční extrakce.
• Rozšíření metodiky na další fytoformulace a multikomponentní extrakty.

Závěr

Vyvinutá HPLC metoda na systému Alliance iS prokázala vysokou přesnost, přesnou rozlišovací schopnost a opakovatelnost při stanovení šesti hlavních withanolidů v kořeni ashwagandhy a komerčních doplňcích. Optimalizovaná ultrazvuková extrakce s rozpouštědlovou směsí ethanol : methanol : voda (60 : 30 : 10) a sonikací 30 min představuje efektivní postup pro kvantitativní analýzu.

Reference

1. Singh P., et al. Biotechnological interventions in Withania somnifera (L.) Dunal. Biotechnol Genet Eng Rev. 2015;31(1–2):1–20.
2. Mirjalili M.H., et al. Steroidal lactones from Withania somnifera, an ancient plant for novel medicine. Molecules. 2009;14(7):2373–2393.
3. Uddin Q., et al. Phytochemical and Pharmacological Profile of Withania somnifera Dunal: A Review. 2012.
4. Maurya R. Chemistry and Pharmacology of Withania coagulans: An Ayurvedic Remedy. J Pharm Pharmacol. 2010;62(2):153–160.
5. Ihsan ul H., et al. Biologically Active Withanolides from Withania coagulans. J Nat Prod. 2013;76(1):22–28.
6. Yadav A., Mishra R.K. Withania somnifera ameliorates sexual arousal and impotence in stressed male rats by modulating neurotransmitters and NO/cGMP/PDE5α pathway. J Ethnopharmacol. 2024;318(Pt B):116971.
7. Nasimi Doost Azgomi R., et al. Effects of Withania somnifera on reproductive system: A systematic review. Biomed Res Int. 2018;2018:4076430.
8. Ganzera M., Choudhary M.I., Khan I.A. Quantitative HPLC analysis of withanolides in Withania somnifera. Fitoterapia. 2003;74(1–2):68–76.
9. Meena A.K., et al. Estimation of withaferin-A by HPLC and standardization of the Ashwagandhadi Lehyam formulation. Heliyon. 2021;7(2):e06116.
10. AOAC SMPR 2015.007: Withanolide Glycosides and Aglycones of Ashwagandha (Withania somnifera). J AOAC Int. 2019;98(4):1104–1105.
11. Dhanani T., et al. Effect of extraction methods on yield, phytochemical constituents and antioxidant activity of Withania somnifera. Arab J Chem. 2017;10:S1193–S1199.
12. Shinde S., et al. Recent advancements in extraction techniques of Ashwagandha with insights on phytochemicals, structural significance, pharmacology, and current trends in food applications. ACS Omega. 2023;8(44):40982–41003.
13. Ji D.D. Dietary supplement test methods liquid chromatography separation techniques and application. 2022.