Natural Food Supplements: Characterization using LC/MS – Ashwagandha, Turmeric and Ginger Examples

Význam tématu

Analýza doplňků stravy pro stanovení bioaktivních látek je klíčová pro ověření kvality, bezpečnosti a soulad s označením. Vzhledem k tomu, že označení obvykle uvádí množství surové suroviny, nikoli konkrétních účinných sloučenin (kurkuminoidy, gingeroly, boswellické kyseliny, withanolidy apod.), je potřeba spolehlivých analytických metod, které umožní kvantifikovat a identifikovat tyto molekuly v komplexních matricích.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vyvinout a demonstrovat LC/MS metodiku pro charakterizaci a kvantifikaci vybraných bioaktivních složek doplňků stravy na příkladech kurkumy (Curcuma longa), zázvoru (Zingiber officinale), Boswellia serrata (boswellické kyseliny) a ashwagandhy (Withania somnifera). Studie porovnává identifikaci pomocí vysokého rozlišení (QTof MSe) a kvantifikaci pomocí triple‑quadrupolu v režimu MRM a ukazuje rozptyl obsahu analyzovaných sloučenin v komerčních produktech.

Použitá metodika

• Vzorkování: komerční doplňky (kapsle, tablety, softgely, gummies) zakoupené online.
• Extrakce: kapsle/tablety – 100 mg materiálu extrahováno 20 mL 50/50 (v/v) H2O/MeOH; softgel – mechanické rozrušení v H2O následované přidáním MeOH; gummy – sonikace v H2O a následné přidání MeOH. Vzorky centrfugovány (4000 g, 5 min), filtrovány (0,22 µm PTFE) a ředěny (10:1, 100:1 nebo 1000:1) před analýzou.
• Kalibrace: komerčně dostupné standardy pro 6‑gingerol, 6‑paradol, kurkumin, boswellické kyseliny (vč. AKBA, ABA), piperin a withaferin A; kalibrační rozsah 0,1–500 ng/mL. Pro sloučeniny bez standardů byla použita relativní kalibrace (analogy jako 6‑G nebo 6‑Paradol pro rodiny příbuzných látek).
• Citlivost: LOQ v roztoku 0,1–1 ng/mL; metoda umožňuje kvantifikaci na úrovni přibližně 0,005 mg/porce po přepočtu z extraktu.

Použitá instrumentace

• Chromatografie: ACQUITY UPLC I‑Class Plus se sloupcem ACQUITY Premier BEH C18, 130 Å, 1,7 µm, 2,1 x 50 mm, provozovaným při 35 °C. Mobilní fáze A = voda s 2,5 mM acetatem amonným; B = methanol. Gradient pro MRM běžel z 5 % B na 95 % B během 0–10 min.
• Hmotnostní spektrometrie: Xevo TQ‑S micro (triple quadrupole) pro MRM kvantifikaci a Xevo G3 QTof MS v režimu MSe pro vysokorozlišovací identifikaci a analýzu fragmentů.
• Ionizace: ESI v pozitivním i negativním módu podle povahy analytu; MRM parametry optimalizovány infuzními/injekčními experimenty.

Hlavní výsledky a diskuse

• Metoda umožnila detekci a identifikaci širokého spektra přírodních produktů v doplňcích: kurkuminoidy (kurkumin, demethoxy‑ a bisdemethoxykurkumin), gingeroly, shogaoly a paradoly, boswellické kyseliny včetně AKBA/KBA/ABA, withanolidy (např. withaferin A) a piperin.
• Vysokorozlišovací MSe data poskytla přesné hmotnosti a fragmentační informace, které pomohly rozlišit složité izobarické a homologické řady v matrice (zejména u ashwagandhy s mnoha withanolidy a flavonoidy).
• Kvantifikace v reálných produktech ukázala značnou variabilitu obsahu bioaktivních látek mezi komerčními přípravky. Příklady ze studie ilustrují rozsahy obsahu (např. u withaferinu A se pohybovalo množství na porci od setin do téměř 1 mg/porci, u gingerolů byly zaznamenány porce s jednotkami mg 6‑gingerolu, u kurkuminoidů byly také patrné velké rozdíly mezi výrobky a přídavky piperinu jako Bioperinu byly rovněž kvantifikovány).
• U řady analytů nebyly k dispozici standardy, proto byla použita relativní kvantifikace, což zvyšuje nejistotu výsledků; studie však prokázala, že i tak lze získat užitečná srovnání a umožnit odhad spotřeby účinných látek z doporučené porce.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda poskytuje robustní nástroj pro kontrolu kvality doplňků stravy: ověření obsahu deklarovaných surovin, zjištění přítomnosti doplňkových aditiv (např. piperin) a monitorování variability mezi šaržemi/výrobky.
• Uplatnění v průmyslových laboratořích, QA/QC odděleních, ve výzkumu farmakognózie a v regulaci potravinových doplňků (podezření na poddávkování, adulteraci nebo nekonzistentní standardizaci).
• Schopnost detekovat nízké koncentrace (LOQ v ng/mL) dává možnost sledovat i stopové úrovně biologicky aktivních látek po přepočtu na doporučené porce.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření panelu sledovaných látek včetně dalších withanolidů, minoritních kurkuminoidů a derivátů gingerolů a shogaolů, doplněné o dostupné izotopově značené interní standardy pro přesnější kvantifikaci.
• Integrace cílených MRM analýz s nestrukturovaným HRMS neboli nontarget screeningem za účelem detekce neočekávaných příměsí či kontaminantů a pro širší profilování matrice.
• Validace metody podle regulačních norem pro rutinní použití v certifikovaných laboratořích a zavedení standardizovaných extrakčních postupů a kontrolních vzorků pro zajištění srovnatelnosti dat mezi laboratořemi.
• Automatizace přípravy vzorků a datové analýzy, využití softwaru pro zpracování MSe fragmentů a strojového učení pro rychlou identifikaci signifikantních markerů kvality.

Závěr

Popsaná LC/MS metodika kombinuje rychlou UPLC separaci, cílenou kvantifikaci pomocí TQ‑MS a potvrzující identifikaci přesným QTof MSe pro efektivní charakterizaci doplňků stravy. Metoda prokáže velkou variabilitu obsahu bioaktivních složek mezi komerčními produkty a poskytuje citlivost potřebnou pro kvantifikaci na úrovni srovnatelné s požadavky QC. Omezení plynoucí z nedostatku dostupných standardů lze částečně řešit relativní kalibrací, ideálním směrem je však širší dostupnost referenčních látek a standardizovaná validace.

Reference

• Waters Corporation. MRM parameters for targeted analytes; details available from the authors upon request.
• Mikulska P., et al. Pharmaceutics. 2023 Mar 24;15(4):1057.