Purity, Assay, and Impurity Profiling of Single-Stranded Oligonucleotides Using Agilent Oligo Analysis Accelerator for OpenLab CDS

Význam tématu

Purifikace, stanovení účinné látky a profilování nečistot u jednovlákenných oligonukleotidů je nezbytné pro zajištění bezpečnosti a účinnosti léčiv. QC laboratoře vyžadují metody, které kombinují citlivost, robustnost a splnění regulačních požadavků.

Ionově párová reverzní fázová LC s hmotnostní spektrometrií (IP-RPLC-MS) je uznávanou technikou pro charakterizaci oligonukleotidů, avšak tradiční workflow jsou často náročné na čas a technickou expertízu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem tohoto přehledu je představit Agilent Oligo Analysis Accelerator jako doplněk pro OpenLab CDS, který zjednodušuje a standardizuje datovou analýzu pro QC u syntetických oligonukleotidů. Studie staví na metodice popsané Rentel et al., kde je pro rutinní lot release navržený single quadrupole detektor.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda využívá ionově párovou RPLC s mobilní fází obsahující tributylammonium acetát a akrylonitril. Eluce je realizována gradientem 45–80 % organické fáze za 22 minut při 50 °C. V ESI zdroji se cíleně formuje převážně čtyřnásobně nabitý iont plnohodnotného produktu. Pro odlišení aduktů a nečistot jsou záznamy získány za dvou různých podmínek: standardních (nízká teplota a proud sušícího plynu) a „harsh“ (vyšší teplota a proud).

Workflow zahrnuje:

1. Kalibraci UV a MS signálu pomocí čtyřbodové křivky.
2. Detekci nečistot nad prahovou hodnotou 0,2–0,3 % relativní abundanci.
3. Automatizovanou extrakci iontových chromatogramů (EIC).
4. Stanovení čistoty UV integrací hlavního píku na základě raných a pozdních elujících impurit.
5. Klasifikaci iontů podle jejich chování při standardních a „harsh“ podmínkách.

Použitá instrumentace

• HPLC: Agilent 1260 Infinity II nebo 1290 Infinity II LC
• Kolona: Agilent AdvanceBio Oligonucleotide 2,1 x 150 mm
• MS detektor: Agilent InfinityLab LC/MSD XT (G6135C), single quadrupole
• Zdroj: ESI v negativním módu
• Přístrojové parametry: přídavné plyny, teploty 260–350 °C, napětí 4000 V

Hlavní výsledky a diskuse

OAA významně zkracuje dobu analýzy díky automatizaci integrací, výpočtů SST a EIC. Při validaci metody bylo dosaženo spolehlivé detekce nečistot na úrovni 0,2 % pro nižší nabité stavy a 0,3 % pro vyšší. Systémové audity a logy zaručují splnění 21 CFR Part 11. Porovnání standardních a „harsh“ podmínek umožňuje rozlišení aduktů od skutečných nečistot.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlejší a standardizované vyhodnocení QC vzorků v laboratořích
• Snížení chybovosti manuálních přepisů a integrací
• Plné pokrytí požadavků na datovou integritu a auditní stopy
• Možnost implementace do rutinního lot release oligonukleotidů a farmaceutických procesů

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace umělé inteligence pro predikci nečistot, rozšíření podpory pro duplexní oligonukleotidy nebo jiné chemické modifikace. Vývoj adaptivních metod XIC pro vysokou hmotnostní řadu, další zlepšení uživatelského rozhraní a propojitelnost s LIMS.

Závěr

Agilent Oligo Analysis Accelerator představuje posun v QC analytice oligonukleotidů, spojuje robustnost single quadrupole MS s plnou automatizací a souladem s regulačními normami. Umožňuje spolehlivou, rychlou a transparentní analýzu čistoty, koncentrace a profilu nečistot.

Reference

• Rentel C; Gaus H; Bradley K; Luu N; Kolkey K; Mai B; Madsen M; Pearce M; Bock B; Capaldi D. Assay, purity, and impurity profile of phosphorothioate oligonucleotide therapeutics by ion pair–HPLC–MS. Nucleic Acid Ther. 2022, 32(3):206–220. DOI 10.1089/nat.2021.0056