INVESTIGATING CYCLIC ION MOBILITY AS A MEANS TO BOOST COVERAGE IN THE TOP-DOWN SEQUENCING OF SYNTHETIC GUIDE RNAS

Význam tématu

Rychlá a spolehlivá charakterizace syntetických guide RNA (sgRNA) je nezbytná pro rozvoj genových terapií založených na CRISPR-Cas9. Top-down sekvenování nabízí možnost minimalizovat přípravu vzorků a zkrátit dobu analýzy. Integrace cyklické iontové mobility (Cyclic IMS) do hmotnostní spektrometrie může významně snížit přetížení spektra produktovými ionty a tím zvýšit sekvenční pokrytí dlouhých RNA molekul.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na ověření přínosu iontové mobility při top-down MS sekvenování čtyř syntetických RNA oligonukleotidů různé délky (25, 50, 75 a 100 nukleotidů). Hlavním cílem bylo porovnat sekvenční pokrytí získané bez mobility a s využitím cyklické IMS a demonstrovat nejvýraznější benefit u delších sgRNA.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky čtyř oligonukleotidů (25mer, 50mer, 75mer, 100mer) byly analyzovány v режиме single-pass na SELECT SERIES Cyclic IMS MS. Před analýzou byly vzorky separovány ACQUITY UPLC Premier systémem s BEH C18 kolonkou (1,7 µm, 2,1 × 100 mm) při 60 °C. Mobilní fáze A obsahovala 7 mM triethylaminu a 80 mM hexafluoroisopropanolu ve vodě, mobilní fáze B 3,5 mM triethylaminu a 40 mM hexafluoroisopropanolu v 50:50 metanol-voda. MS/MS data byla získána v HDMSE režimu s trap collision energií rampovanou mezi 20–37 V dle délky oliga. Iontová mobilita spektra byla rozdělena do 3–5 frakcí, extrahovaných a vyhodnocených v softwaru Driftscope v3.0 a CONFIRM sequence (waters_connect).

Použitá instrumentace

• SELECT SERIES Cyclic IMS (single pass ion mobility).
• ACQUITY UPLC Premier s BEH C18 kolonkou.
• TOF analyzátor s rozlišením Rp = 100 000 FWHM (W mode).
• Softwary Driftscope v3.0 a CONFIRM sequence (waters_connect).

Hlavní výsledky a diskuse

Implementace iontové mobility přinesla nárůst počtu identifikovaných terminálních fragmentů a výrazné zvýšení sekvenčního pokrytí u delších sgRNA:

• 25mer: pokrytí 100 % bez mobility a s mobility (nárůst z 101 na 111 fragmentů).
• 50mer: z 96 % na 100 % (125 → 146 fragmentů).
• 75mer: z 67 % na 96 % (135 → 186 fragmentů).
• 100mer: z 50 % na 74 % (134 fragmentů → zvýšení coverage výrazné).

Analýza ukázala, že u kratších oligonukleotidů je spektrální přetížení nízké, proto je přínos mobility menší. Naopak u delších sgRNA, kde je počet možných fragmentů vysoký, mobilita významně uvolní spektrum a usnadní přiřazení.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda kombinuje rychlost top-down fragmentace s rozlišením mobilitní separace, což přináší:

• Vyšší spolehlivost sekvenčního pokrytí dlouhých RNA.
• Zkrácení analytického workflow díky minimalizaci předběžných úprav.
• Jednodušší automatizaci vyhodnocení fragmentů v softwaru.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze dále rozvíjet následujícími směry:

• Začlenění interních fragmentů pro ještě vyšší pokrytí.
• Vícepásmová cyklická mobilita pro lepší rozlišení.
• Rozšíření aplikace na jiné terapeutické oligonukleotidy a dlouhé RNA sekvence.
• Integrace ECD/ETD fragmentačních technik pro komplementární informace.

Závěr

Cyklická iontová mobilita v top-down MS výrazně zlepšuje pokrytí syntetických guide RNA, zejména u delších sekvencí, kde spektrální přetížení omezuje klasické přístupy. Unikátní geometrie SELECT SERIES Cyclic IMS a vysoké rozlišení TOF analyzátoru společně poskytují efektivní nástroj pro QC a výzkum CRISPR-Cas9 terapeutik.

Reference

1. Avtonomov D. M., Polasky D. A., Ruotolo B. T., Nesvizhskii A. I. Anal. Chem. 2017, 90(3):2369–2375.
2. Shaw J. B., Cooper-Shepherd D. A., Hewitt D., Wildgoose J. L., Beckman J. S., Langridge J. I., Voinov V. G. Anal. Chem. 2022, 94(9):3888–3896.